yap在细胞衰老中的作用机制研究细胞生物学专业论文.docxVIP

北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文 北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文 目录 前 言 22 材料与方法 ．．25 1．实验材料 25 2．实验方法 ．．29 2．1．质粒DNA的制备 29 2．2．限制性内切酶反应体系 29 2．3．DNA的回收与纯化 ．．30 2．4．目的基因的定向克隆及鉴定 30 2．5．哺乳动物细胞转染 30 2．6．使用TRIZOL提取细胞，e2,RNA ．3 1 2．7．RT-PCR扩增 32 2．8．实时定量PCR实验 一32 2．9．细胞总蛋白提取 33 2．10．核浆蛋白分提 ．．33 2．11．蛋白质浓度测定 ．34 2．12．SDS．聚丙烯酰胺凝胶电泳和转膜 ．34 2．13．检测转移到硝酸纤维素膜上的目的蛋白 ．35 2．14．双荧光素酶报告基因实验 ．36 2．1 5．MTT法检测细胞生存率 ．36 2．16．染色质免疫沉淀实验 ．36 2．17．免疫荧光 ．40 2．18．免疫组化 ．40 2．1 9．三维培养 ．4 l 2．20．染色衰老相关的D一半乳糖苷酶染色 ．42 2．21．GSEA ． ．． ． 42 2．22．点突变 ．42 2．23．评分及统计 ．43 结 果 44 1．低浓度阿霉素诱导细胞衰老 一44 1．1．细胞衰老模型的建立 44 1．2．细胞衰老相关表型的检测 45 1．3．细胞衰老后的形态变化 46 1．4．衰老细胞的表面张力得以维持 47 万方数据 北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文 北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文 目录 2．细胞逃逸衰老而继续生长 ．．49 3．阿霉素诱导的衰老细胞中YAP／TAZ活性增高 50 3．1．YAP／TAZ在阿霉素诱导的衰老细胞的胞核内积累 51 3．2．YAP／TAZ的转录活性增高 53 33．YAP转录谱的富集 55 4．YAP的入核利于衰老细胞的存活 ．．57 4．1．活化的YAP抵抗细胞衰老的发生 ．．58 4。2．YAP的敲降促进细胞凋亡的发生 60 5．YAP促进SURVIVIN的表达以维持衰老细胞的活性 ．．62 5．1．YAP的活化促进survivin的表达 ．62 5．2．Survivin在衰老细胞的核内积累 ．63 5。3．抑制YAP能够降低survivin的表达并促进凋亡 ．．64 5．4．抑制survivin可以诱导衰老细胞凋亡 65 6．YAP在体内衰老细胞中的表达情况 ．．66 6．1．APCM斛小鼠的成瘤能力得以验证 ．．66 6．2．APCM叶小鼠肾脏组织中检测到细胞衰老的发生 ．．67 6．3．[3-catenin在肠上皮组织中表达差异显著 68 6．4．YAP在肠上皮组织中表达差异显著 ．70 讨论 ．j： 73 1．阿霉素诱导的细胞衰老与细胞凋亡 ．．75 2．细胞逃逸衰老的猜想 ．．76 3．细胞衰老的扁平增大表型 ．．77 4．YAP与细胞衰老的关系 ．．78 5．SURVIVIN与细胞衰老 80 6．衰老细胞的及时清除有异于抑制肿瘤的发生发展 ．．8 1 7．低浓度阿霉素的应用前景 ．．82 总 结 83 参考文献 一84 资助基金 ．96 致谢 97 个人简介 ．98 独创性声明 100 万方数据 北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文 北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文 图表索弓 图表索引 图目录： 图1细胞衰老的信号通路 ．10 图2衰老细胞表观遗传学组的改变可能会促进老年人类肿瘤的发生率 ．20 图3点突变示意图 ．43 图4低浓度阿霉素诱导细胞衰老 ．44 图5细胞衰老表型检测 ．46 图6衰老的细胞扁平增大 ．47 图7衰老细胞的表面张力得以维持 ．48 图8三维培养阿霉素诱导的衰老细胞 ．49 图9长期培养低浓度阿霉素诱导的衰老细胞 ．50 图：tO YAP在阿霉素诱导组与对照组细胞中的免疫荧光染色 51 图11 TAZ在阿霉素诱导组与对照组细胞中的免疫荧光染色 ． 52 图12核浆分提检测YAP ．．j ．53 图13 Q．PCR检测YAP／TAZ的转录活性 ．54 图14 YAP／TAZ转录活性改变 55 图15基因集富集分析 56 图16热图分析 57 图17 Western blot验证YAP与YAP8127A质粒的表达 ．58 图18 YAP的活化抵抗细胞衰老的发生 59 图19 q．PCR与Western blot验证YAP siRNA的效果 60 图20 YAP的敲降促进了细胞凋亡而非细胞衰老 61 图21阿霉素诱导的衰老细胞中survivin的表达上调 63 图22 Survivin的免疫荧光检测 ．64 图23维替泊芬降低了YAP的转录活性并促进了阿霉素诱导的衰老细胞的凋亡 ．61； 图24 Su