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CRISPR/cas9基因编辑技术及应用 ——— 一种来源于细菌获得性免疫由RNA指导Cas蛋白对靶向基因获得性修饰的技术 1. CRISPR-Cas系统简介 1987 年，日本课题组在K12 大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，2002 年，正式将其命名为成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR) 2005 年发现CRISPR 的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源，推测细菌可能通过CRISPR 系统可能以类似于真核生物的RNAi 方式抵抗外源遗传物质的入侵。 2013 年初，MIT 的研究组首次利用CRISPR/Cas9 系统对人293T 细胞EMX1 和PVALB 基因以及小鼠Nero2A 细胞Th 基因实现了定点突变。 1.2 .CRISPR/Cas9作用机理 CRISPR-Cas系统的结构：CRISPR-CAS 系统的组成主要包括: 由不连续的重复序列R( repeat) 与长度相似的间区序列S( spacers) 间隔排列而成的CRISPR 簇，前导序列L( leader) 以及一系列CRISPR 相关蛋白基因cas。 Cas蛋白是一种双链DNA核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。 CRISPR/cas9作用机理 1.CRISPR 的高度可变的间隔区的获得 首先识别入侵的核酸和扫描外源 DNA 潜在的 PAM（NGG序列），将临近 PAM 的序列作为候选protospacer；然后在 CRISPR 基因座的5端合成重复序列；最后新的间隔序列整合到两个重复序列之间 2.CRIPSR 基因座的表达(包括转录和转录后的成熟加工) 3.CRISPR/Cas 系统活性的发挥或者是对外源遗传物质的干扰 2.CRISPR/cas9技术的应用 CRISPR-Cas9介导的基因组精确编辑技术 CRISPRs技术是一种由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（singleguideRNA）。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作 Cas9技术介导单基因细胞系敲除的实验流程（Cas9质粒建立knock-out细胞系） 1、设计识别靶位点的一对DNA Oligos 选择PAM（NGG）5‘端的一段碱基序列20nt作为原间隔序列，即敲除的靶位点。 确定待敲除位点后，选择23-至250bp的外显子序列输入到在线免费设计sgRNA的软件Input框中，然后进行设计运算，软件会自动输出sgRNA序列。利用在线软件可以选择脱靶机会小的序列作为sgRNA模板序列。 2.构建可表达sgRNA的质粒 3..sgRNA活性检测 4.利用Cas9质粒建立knock-out细胞系 CRISPR/Cas9技术基因敲除实例流程 CRISPR/技术的前景及优缺点 1CRISPR-Cas9技术的优势 而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比TALENs更容易操作，因为每一对TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替换20个核苷酸就行。 只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不具特异性。 编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构TALENs和ZFNs更简单方便。 较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复TALENs编码载体带来的并发症。 2.CRISPR/Cas9技术的缺点 1.脱靶效应 CRISPR/技术的前景及优缺点 3.2 CRISPR-Cas9系统的应用前景 1.在基因敲除方面具有绝对的优势 2.可以用于因单基因突变造成的遗传病治疗 3.在家畜及农业育种方面带来新的基因编辑技术