泛耐药鲍曼不动杆菌临床株w61耐药与播散机制的基因组学研究临床医学内科学传染病学专业论文.docxVIP

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泛耐药鲍曼不动杆菌临床株w61耐药与播散机制的基因组学研究临床医学内科学传染病学专业论文

天津医科大学博士学位论文中文摘要 天津医科大学博士学位论文 中文摘要 鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,Ab)是医院内感染中常见的一种病 原菌,其耐药问题日趋严重,中国CHINET细菌耐药性监测报告,2010年鲍曼 不动杆菌泛耐药株分离率高达21.4%,较2009年17.0%又有所增加,且均高于 同年铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、肠杆菌科细菌的泛耐药株分离率。多重耐 药和泛耐药的鲍曼不动杆菌,已成为临床亟待解决的棘手难题。近年来,随着 高通量测序技术的快速发展,基因组学和比较基因组学的研究方法为细菌学领 域引入新的研究平台。本实验采用微生物学、分子生物学和生物信息学分析方 法揭示泛耐药鲍曼不动杆菌临床株W61的多重耐药和耐药播散的机制,为指导 临床合理使用抗菌药物,避免或减少细菌耐药性的出现,防控细菌耐药播散, 研发新型抗菌药物和新作用靶位提供依据。 研究目的 1、 了解泛耐药鲍曼不动杆菌临床株W61的基因组基本特征,分析其多重耐药 表型与耐药基因型。 2、 了解泛耐药鲍曼不动杆菌临床株W61基因组中外排泵系统的分布,分析外 排泵(AdeABC、AdeIJK、AdeFGH、AbeM、AbeS、CraA、MdtL、AmvA及 ABTJ 00034/35/36、ABTJ 00275/276/277等5个功能未知的外排泵)和外膜蛋 白(OmpA、OmpW)的表达,探索外排泵和外膜蛋白在菌株多重耐药中的作用。 3、 了解泛耐药鲍曼不动杆菌临床株W61基因组中可移动元件(整合子、转座 子、插入序列、质粒)的分布,探讨耐药播散机制。 研究方法 1、 菌株收集与药敏试验:收集自2009年天津市某三级甲等医院临床分离的鲍 曼不动杆菌W61,经常规、生化、APl20NE纸条鉴定。采用微量肉汤稀释法和 琼脂纸片扩散法测定鲍曼不动杆菌W61对16种常用抗菌药物(哌拉西林他唑巴 坦、头孢氨噻肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢哌酮、头孢吡肟、头孢哌酮/舒巴 坦、阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、莫西沙星、亚 胺培南、美罗培南、多粘菌素)的MIC值(或抑菌圈直径),确定其耐药表型。 2、全基因组高通量测序与序列分析:应用Roche 454 FLX测序平台,对鲍曼不 动杆菌临床株W61进行全基因组测序,利用相关软件和聚合酶链式反应(PCR) 天津医科大学博士学位论文填补空缺片段,拼接完整的基因组序列,提交Genbank。应用BASys细菌注释 天津医科大学博士学位论文 填补空缺片段,拼接完整的基因组序列,提交Genbank。应用BASys细菌注释 系统进行基因组和质粒的基因注释,分析菌株耐药表型与耐药基因型的关系。 3、 泵抑制剂干预试验与外排泵及外膜蛋白基因表达检测:采用微量肉汤稀释 法测定未加用和加用泵抑制剂CCCP时鲍曼不动杆菌临床株W61对8种抗菌药 物(左氧氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、氯霉素、庆大霉素、阿米卡星、头孢 他定、头孢哌酮/舒巴坦)的MIC值,了解泵抑制剂对菌株耐药表型的影响。应 用TransDB数据库分析多重耐药株W61基因组中外排泵系统的分布情况。选取 鲍曼不动杆菌ATCCl7978为对照株,以recA为内参基因,采用实时荧光定量 RT—PCR方法对鲍曼不动杆菌W61和ATCCl7978的13种外排泵基因(adeB、 adeJ、adeG、abeM,abeS、craA,mdtL,amvA及ABTJ一00035、ABTJ一00276 等5个功能未知的泵基因)和2种外膜蛋白基因(ompA、ompW)mRNA的表 达进行相对定量分析。泛耐药株W61外排泵AdeABC的调控系统AdeRS、外排 泵ABTJ 00034/35/36上游调控序列ABTJ 00033和外排泵AdeFGH的调控系统 AdeL的结构基因,与GenBank公布的ATCCl7978相应序列进行比对分析。 4、可移动元件分布:应用Genbank.nr和IS finder数据库,经序列比对分析鲍曼 不动杆菌临床株W61基因组中可移动元件(整合子、转座子、插入序列、质粒) 的分布及其携带的耐药基因,分析可移动元件在菌株耐药性的水平播散中的作 用。 研究结果 1、 药敏试验结果:鲍曼不动杆菌临床株W61对抗假单胞菌头孢菌素、碳青霉 烯类抗菌药物、含舒巴坦的复合制剂、氟喹诺酮类抗菌药物和氨基糖苷类抗菌 药物均耐药,对多粘菌素敏感,为泛耐药株。 2、基因组序列分析:泛耐药株W61基因组(Genbank登录号CP003500)全长 3964912bp,平均GC含量为39.11%,包含3731个蛋白质编码基因,6个rRNA 编码基因,74个tRNA编码基因;泛耐药株W61携带2个质粒,plasmidA全长 77528bp,

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