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项目二 淀粉酶的制备及活力测定 姓名:张婉月 班级:生物制药1311 学号:2013040829 组别:第2组 指导老师:彭加平 韦平和 目录 背景知识 实训原理 实验材料及仪器 实训步骤 注意事项 参考文献 背景知识 淀粉是植物最主要的贮藏多糖,也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用。 淀粉酶属于水解酶类,是催化淀粉、糖原、糊精中糖苷键水解的一类酶的统称。此类酶广泛存在于动植物和微生物中。根据对淀粉的作用方式不同,可将淀粉酶分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、脱支酶。 酶的活力是酶的重要参数,反映的是酶的催化能力,因此测定酶活力是研究酶的基础。 α -淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分α -1,4糖苷键,单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、α-极限糊精和少量葡萄糖。Ca 2+能使α-淀粉酶活化和稳定,它比较耐热但不耐酸,pH 3.6 以下可使其钝化。 β-淀粉酶从非还原端作用于α-1,4糖苷键,遇到支链淀粉的α -1,6键时停止。单独作用时产物为麦芽糖和β-极限糊精。β-淀粉酶是一种巯基酶,不需要 Ca 2+ 及 Cl —等辅助因子,最适pH偏酸,与α -淀粉酶相反,它不耐热但觉耐酸,60 ℃保温15min可使其钝化。 α-淀粉酶活力测定常用的方法 α-淀粉酶的工业应用 焙烤工业 淀粉工业 啤酒酿造 酒精工业 纺织退浆 造纸 清洁剂 实训原理: 淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质从而被机体利用。淀粉酶主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶两种。α-淀粉酶可随机作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键,生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖,同时使淀粉的黏度降低,因此又称为液化酶。β-淀粉酶可从淀粉的非还原末端进行水解,每次水解下一分子麦芽糖,又被称为糖化酶。 实训原理: 淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线,用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量,以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。 淀粉酶存在于几乎所有植物中,特别是萌发后的禾谷类种子,淀粉酶活力最强,其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。两种淀粉酶特性不同,α-淀粉酶不耐酸,在pH3.6以下迅速钝化。β-淀粉酶不耐热,在70℃15min钝化。 实验材料及仪器 1、材料 萌发的小麦(或稻谷)种子(芽长约1cm)。 2、仪器设备 分光光度计;离心机;恒温水浴(37℃,70℃,100℃);具塞刻度试管;刻度吸管;100mL容量瓶2个;25mL比色管15支;试管8支;电子天平;研钵。 试剂及配制 (1)标准麦芽糖溶液(1mg/mL):精确称取100mg麦芽糖,用蒸馏水溶解并定容至100mL; (2)3,5-二硝基水杨酸试剂:精确称取1g3,5-二硝基水杨酸1g,溶于20mL1mol/L NaOH溶液中,加入50mL蒸馏水,再加入30g酒石酸钾钠,待溶解后用蒸馏水稀释至100mL。盖紧瓶塞,勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用; 试剂及配制 (3) 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液: A液(0.1mol/L 柠檬酸):称取C6H8O7.H2O 21.01g,用蒸馏水溶解并定容至1L; B液(0.1mol/L 柠檬酸钠):称取Na3C6H5O7.2H2O 29.41g,用蒸馏水溶解并定容至1L。 取A液13.7mL与B液26.3mL混匀,即为0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液; (4)1%淀粉溶液:称取1g淀粉溶于100mL0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。 (5) 0.4M NaOH 实训步骤 1、称取1g萌发3天的小麦种子,置于研钵中。 2. 加入少量的石英砂和2mL的蒸馏水,研磨匀浆。 3. 将匀浆倒入离心管中,用6mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取15至20分钟。每隔数分钟搅动一次,使其充分提取。 4. 然后在3000r/min速下离心10分钟。 5. 将上清液过滤,倒入100mL容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度,摇匀,即制得α-淀粉酶原液。装入试剂瓶中,贴标签,保存于低温冰箱中,为以后的实验使用。 1、麦芽糖标注曲线的制作 取7支干净的具塞刻度试管,号,按表1加入试剂: 摇匀,置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却,加馏水定容至20mL。以1号管作为空白调零点,在520nm波长下比色测定吸光度值。以麦芽糖含量为横坐标,光密度为纵坐标,绘制标准曲线。 2、淀粉酶液的制备 称取1g萌发3天的小麦种子(芽长约1cm),置于研钵中,加入少量石英砂和2mL蒸馏水,研磨匀浆。将匀浆倒入离心管中,用6mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取15~20m
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