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实验八 T淋巴细胞转化试验 检测方法: 形态学计数法 MTT法 同位素法 实验目的 实验原理 试剂与器材 操作步骤 结果判断 注意事项 实验讨论 一、形态学计数法 实验目的 1.掌握T淋巴细胞转化试验的原理。 2.熟悉淋巴母细胞的形态特征及判定方法。 T淋巴细胞在有丝分裂原PHA等刺激后,细胞的形态和代谢发生变化,发生一系列增殖反应,如出现细胞体积增大、核染色质疏松、蛋白质和核酸合成增加,并转化为淋巴母细胞。 试剂与器材 1. RPMIl640 培养液 。包含: 小牛血清10%、青霉素 100u/m1 、链霉素 100ug/m1,用无菌的3% NaHCO3 调 pH 至 7.2~7.4。 2. 植物血凝素(PHA)。用含10%小牛血清的RPMI 培养液稀释至500~1000?g/ml。 试剂与器材 3. 姬姆萨染液。 4. 标本 肝素抗凝人外周静脉血。 5.器材 细胞培养瓶、CO2培养箱、超净台、高压灭菌器、无菌过滤装置、离心机、显微镜等。 1.取肝素抗凝血0.2ml,注入预先加有1.8 ml RPMI 1640培养液的培养瓶内,同时加入PHA(500?g/ml )0.1 ml,对照瓶内不加PHA。混匀后置37?C、5%CO2培养箱内孵育72h,期间每天旋转摇匀一次。 2.培养结束后,弃去上清,混匀细胞,加入离心管中,1500rpm 离心10min。 3.弃上清,吸取白细胞层制片,自然干燥。 4.甲醇固定1~2min后,姬姆萨染色15~20min,水洗,干燥。 5.油镜下计数200个淋巴细胞,观察淋巴细胞的形态变化,计算淋巴细胞转化率。 四、结果观察 可以见到以下几种类型细胞 (1) 成熟的小淋巴细胞:与未经培养的小淋巴细胞一样为 6 -8 um ,核染色致密,无核仁,核与胞浆比例大,胞浆染色为轻度嗜碱性。 (2) 淋巴母细胞: 细胞体积增大,约 20 - 30 um ,形态不整齐,常有小突出,核质染色疏松,有核仁 l - 2 个,胞浆变宽,常出现胞浆空泡。 (3) 过渡型淋巴细胞: 比小淋巴细胞大,约 l0 - 20 u m ,核染色致密,但出现核仁,此为与成熟小淋巴细胞鉴别要点。 (4) 其它细胞: 如中性粒细胞在培养 72h 后,绝大部分衰变或死亡,呈碎片。 2 .淋巴细胞转化率的计算:按上述分类检查推片头、体、尾三部分,分别计数淋巴母细胞、过渡型母细胞和核有丝分裂相细胞以及成熟的小淋巴细胞,以前三者为转化细胞,每份标本计数200个细胞,按下列公式计算转化率: 在正常情况下, PHA 诱导的淋巴细胞转化率为 60 %一 80 %,如为 50 %一 60 %则偏低, 50 %以下则为降低。 1 .培养基成分对转化率影响较大,注意其有效期。 2 .小牛血清用前需灭活。 3 .培养时要保证有足够的气体,保证无菌。 4 . PHA 剂量过大对细胞有毒性,PHA 转化反应剂量一般 10m1,培养瓶内液体总量不要超过 2m1 ,太小不足以刺激淋巴细胞转化,试验前应先测定。 二、MTT比色法 实验目的 熟悉MTT比色法进行淋巴细胞转化试验的原理及其操作方法。 一、原理 T淋巴细胞受到PHA作用后发生活化增殖,其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高,四甲基噻唑蓝(MTT)作为其底物参与反应,被催化形成蓝紫色结晶甲臢(fomazan) ,经盐酸─异丙醇或溶解后为蓝色溶液。甲臢的形成量与细胞增殖活化的程度呈正相关。 试剂与器材 1. RPMIl640 培养液 。 2. 植物血凝素(PHA)。 3. 标本 肝素抗凝人外周静脉血。 4. 器材 超净台、96孔细胞培养板、 CO2培养箱、高压灭菌器、无菌过滤装置、振荡器、酶联免疫检测仪等。 1.先采用密度梯度离心法分离外周血单个核细 胞,并用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液调 整细胞浓度至1?106/ ml。 2.将细胞悬液加入96孔培养板中,100?l/孔, 每个样品三个复孔,并设相应对照孔。实验孔 加含50?g/ml的PHA(终浓度5?g/ml) 100?l, 对照孔加不含PHA的1640培养液100?l, 3.混匀后置37?C、5% CO2培养箱内培养68h。 4.将培养板1500 rpm离心10min,吸弃上清 液,每孔加MTT20?l,混匀,继续培养4h 后,每孔加100?l盐酸异丙醇,低速振荡10 min。 5.充分溶解后,采用酶联免疫检测仪双波长 570nm/630nm测定各孔A值,
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