T淋巴细胞转化实验.pptVIP

实验八 T淋巴细胞转化试验 检测方法： 形态学计数法 MTT法 同位素法 实验目的 实验原理 试剂与器材 操作步骤 结果判断 注意事项 实验讨论 一、形态学计数法 实验目的 1.掌握T淋巴细胞转化试验的原理。 2.熟悉淋巴母细胞的形态特征及判定方法。 T淋巴细胞在有丝分裂原PHA等刺激后，细胞的形态和代谢发生变化，发生一系列增殖反应，如出现细胞体积增大、核染色质疏松、蛋白质和核酸合成增加，并转化为淋巴母细胞。 试剂与器材 1. RPMIl640 培养液 。包含： 小牛血清10%、青霉素 100u/m1 、链霉素 100ug/m1，用无菌的3% NaHCO3 调 pH 至 7.2～7.4。 2. 植物血凝素（PHA）。用含10%小牛血清的RPMI 培养液稀释至500～1000?g/ml。 试剂与器材 3. 姬姆萨染液。 4. 标本 肝素抗凝人外周静脉血。 5．器材 细胞培养瓶、CO2培养箱、超净台、高压灭菌器、无菌过滤装置、离心机、显微镜等。 1．取肝素抗凝血0.2ml，注入预先加有1.8 ml RPMI 1640培养液的培养瓶内，同时加入PHA(500?g/ml )0.1 ml，对照瓶内不加PHA。混匀后置37?C、5%CO2培养箱内孵育72h，期间每天旋转摇匀一次。 2．培养结束后，弃去上清，混匀细胞，加入离心管中，1500rpm 离心10min。 3．弃上清，吸取白细胞层制片，自然干燥。 4．甲醇固定1～2min后，姬姆萨染色15～20min，水洗，干燥。 5．油镜下计数200个淋巴细胞，观察淋巴细胞的形态变化，计算淋巴细胞转化率。 四、结果观察 　可以见到以下几种类型细胞 　(1) 成熟的小淋巴细胞：与未经培养的小淋巴细胞一样为 6 -8 um ，核染色致密，无核仁，核与胞浆比例大，胞浆染色为轻度嗜碱性。 　 　(2) 淋巴母细胞： 细胞体积增大，约 20 - 30 um ，形态不整齐，常有小突出，核质染色疏松，有核仁 l - 2 个，胞浆变宽，常出现胞浆空泡。 (3) 过渡型淋巴细胞： 比小淋巴细胞大，约 l0 - 20 u m ，核染色致密，但出现核仁，此为与成熟小淋巴细胞鉴别要点。 (4) 其它细胞： 如中性粒细胞在培养 72h 后，绝大部分衰变或死亡，呈碎片。 2 ．淋巴细胞转化率的计算：按上述分类检查推片头、体、尾三部分，分别计数淋巴母细胞、过渡型母细胞和核有丝分裂相细胞以及成熟的小淋巴细胞，以前三者为转化细胞，每份标本计数200个细胞，按下列公式计算转化率： 在正常情况下， PHA 诱导的淋巴细胞转化率为 60 ％一 80 ％，如为 50 ％一 60 ％则偏低， 50 ％以下则为降低。 1 ．培养基成分对转化率影响较大，注意其有效期。 　2 ．小牛血清用前需灭活。 　3 ．培养时要保证有足够的气体，保证无菌。 　4 ． PHA 剂量过大对细胞有毒性，PHA 转化反应剂量一般 10m1，培养瓶内液体总量不要超过 2m1 ，太小不足以刺激淋巴细胞转化，试验前应先测定。 二、MTT比色法 实验目的 熟悉MTT比色法进行淋巴细胞转化试验的原理及其操作方法。 一、原理 T淋巴细胞受到PHA作用后发生活化增殖，其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，四甲基噻唑蓝（MTT）作为其底物参与反应，被催化形成蓝紫色结晶甲臢(fomazan) ，经盐酸─异丙醇或溶解后为蓝色溶液。甲臢的形成量与细胞增殖活化的程度呈正相关。 试剂与器材 1. RPMIl640 培养液 。 2. 植物血凝素（PHA）。 3. 标本 肝素抗凝人外周静脉血。 4. 器材 超净台、96孔细胞培养板、 CO2培养箱、高压灭菌器、无菌过滤装置、振荡器、酶联免疫检测仪等。 1.先采用密度梯度离心法分离外周血单个核细 胞，并用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液调 整细胞浓度至1?106/ ml。 2．将细胞悬液加入96孔培养板中，100?l/孔， 每个样品三个复孔，并设相应对照孔。实验孔 加含50?g/ml的PHA(终浓度5?g/ml) 100?l， 对照孔加不含PHA的1640培养液100?l， 3．混匀后置37?C、5% CO2培养箱内培养68h。 4．将培养板1500 rpm离心10min，吸弃上清 液，每孔加MTT20?l，混匀，继续培养4h 后，每孔加100?l盐酸异丙醇，低速振荡10 min。 5．充分溶解后，采用酶联免疫检测仪双波长 570nm/630nm测定各孔A值，