生物制品生产所用细胞基质支原体检查1.PDF

MycoplasmaTesting JPXVII 生物制品生产所用细胞基质的支原体检查1 本文描述了目前生物制品生产中所用的细胞基质支原体检测方法。 支原体检测建议所用的方法包括：A.培养法；B.指示细胞培养法；C.核酸扩增法 （NAT）。 主细胞库、工作细胞库以及生产过程中的细胞培养都应进行支原体检查。检查应同时采用 方法A 和方法B。需指出的是方法C 可在进行适当的验证后替代方法A 和/或方法B。 采用方法A 或方法B 之前，应先确认样本中是否存在抑制支原体生长的因子。如果测试到 抑制生长的因子，应采用合适方法中和或去除该物质，比如离心或细胞传代。 如果样本在获得后24 小时内就进行检查，可存放于2-8℃。如果超过24 小时，样本应存 放在-60℃或更低温度。 如果样本中检查到了有支原体，进行支原体菌株的鉴定有助于确定污染源。 A. 培养法 1. 培养基 同时采用琼脂平板和肉汤培养基。每一批琼脂平板和肉汤培养基应不含除青霉素以外的其 2 他抗生素。参考 《生物制品最低要求》 中的有关培养基选择。如果能够满足下述第2 条所描述 的要求，其他培养基也可以采用。 2. 培养基适用性 每一批培养基都应检查支原体的生长特性。为了证明所选培养基能够检测已知支原体，每 次检查都应设置质控。质控至少包括有2 种已知种属或株型的支原体，其中之一应是葡萄糖发 酵的 （如肺炎支原体 ATCC 15531，NBRC 14401或与之相当的种属或株型），另一种应该是精 氨酸水解的 （如口腔支原体 ATCC23714，NBRC 14477 或与之相当的种属或株型）。用于阳性 质控的支原体菌株应代数较低且来源于官方或权威机构，并恰当处理。以100CFU 或 100CCU 或更少量接种于培养基。 3. 培养和观察 1) 均匀接种不少于0.2mL 的检查样本 （细胞悬浮液）于两块或更多块琼脂平板上。平板表面 干燥后，放于含5-10% CO 的氮气环境中，35-37℃培养不少于14 天。 2 2) 接种不少于10mL 的检查样本（细胞悬浮液）于两管或更多管100mL 肉汤培养基中，35-37℃ 培养。 如果培养基中含任何生长抑制因子，如抗生素，这些抑制因子应去除。生长抑制因子的验 1 MycoplasmaTesting JPXVII 2 证测试参考 《生物制品最低要求》 中有关生长抑制因子检测中所描述的。 3) 分别在培养到第3，7，14 天的各管中取0.2mL 的肉汤培养物涂布于两块或更多的琼脂平 板上。每2 天或3天观察肉汤培养，如果颜色发生变化，则再次涂布于新的琼脂平板上。平板 放于含5-10% CO 的氮气环境中，35-37℃培养不少于14 天。 2 4) 所有平板在第7天和第 14 天，用显微镜在100 倍或更大倍数下检查克隆数。 B. 指示细胞培养法 采用Vero细胞基质，100CFU或100CCU或更少量的猪鼻支原体（ATCC29052,ATCC 17981, NBRC14858或与之相当的种属或株型）和口腔支原体 （ATCC23714，NBRC 14477 或与之相当 的种属或株型）预先测试方法的适用性。 其他细胞基质和支原体菌株如果检测已知支原体的灵敏度与上述细胞基质和支原体相当或 更高，也可以采用。支原体菌株应代数较低且来源于官方或权威机构，处理过程应得当，接种 前应确定接种量。细胞基质应来源于有资质的细胞库且保证无支原体污染。获得的细胞进行培 养、传代，制备无支原体污染的足量的种子细胞。种子细胞采用本文描述的至少一种方法检测 支原体确保无污染，然后冻存。每次测试都应从库中取一管新的细胞且确保代数在6代以内。 将盖玻片放于细胞培养皿或相当的容器中，指示细胞应在盖玻片上培养1天。接种至少1mL 测试样本 （细胞培养上清）至2 个或更多的细胞培养皿中。 该测试应包括1个阴性对照（未感染）和2 个阳性支原体对照，如猪鼻支原体（ATCC