W7-免疫学常用实验方法.pptVIP

* 密度梯度离心法:在人骨髓或脐带血中，单个核细胞包括干细胞，淋巴细胞和单核细胞，一般认为，干细胞在形态上为淋巴样细胞，其密度与淋巴及单个核细胞的密度基本相同。 单抗贴壁铺展法:利用抗原抗体结合，在培养板上用抗体包被 上述方法适用于造血细胞，实体组织的干细胞分离需要在组织消化的基础上进行。 * 步骤2的处理时使MEF失去增殖能力单细胞克隆 * 设门分析 可以通过设“门” (Gate)，分析、分选感兴趣的细胞。 实验对照的设计 阴性对照：常用同型抗体对照 阳性对照：单阳性对照（多色分析时用于仪器校正） 抗体的选择 首选直标抗体 荧光分子 实验标本的处理 单细胞悬液的制备 抗体浓度 非特异结合的去除：洗涤和封闭 4. Western Blott 5. Hybridoma Technique Monoclonal Antibody Preparation Jerme，K?hler and Milstein 1984 Nobel Prize B cell Myeloma Secrete Ab Clonal A clonal cell line secreting specific Ab ? B cell Myeloma Fusion B cell B cell+Bcell B cell+Myeloma Myeloma Myeloma+Myeloma alive B cell+Myeloma Myeloma Myeloma+Myeloma DNA A(氨基喋呤) HGPRT+， TK+ H, 次黄嘌呤 T, 胸腺嘧啶 HGPRT-， TK- Die HGPRT-， TK- H, 次黄嘌呤 T, 胸腺嘧啶 A clonal cell line secreting specific Ab---Hybridoma HGPRT 次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase) TK 胸腺嘧啶激酶 (Thymidine kinase) Preparing mAbs from murine ascites Pristane (i.p.) Hybridoma (i.p.) ascites Monoclonal antibody ELISA II. Assay for cell function Proliferation: T cell, tumor cell, … Cytotoxic assay : T cell, NK cell, … Cell Proliferation Stimulators Nonspecific: Mitogen : LPS, ConA, PHA Superantigen(超抗原): SEB Cytokine : IL2, IL4, TNF Antibody: CD3, TCR, CD28 Specific: specific antigen:破伤风类毒素，PPD(纯结核蛋白衍生物) MHC: 同种异体细胞(MLR,混合淋巴细胞培养) Assay for T cell proliferation 3H-TdR wash Stimulate Assay a. 3H-TdR b. MTT Assay Mechanism: ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 操作简单，重复性差 c. CFSE Figure 15.67 Following cell proliferation in human peripheral blood lymphocytes using the CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit C34554). Human peripheral blood lymphocytes were harvested and stained with CellTrace CFSE (carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester; 5(6)-CFDA, SE) on Day 0. A portion of the population was arrested at the parent generation using mitomycin C (red peak). The remainder of the sample was stimulated with phyto