何水林版基因工吧程第三章分子克隆载体.ppt

第三章? 分子克隆载体（Molecular cloning vectors） 周毅峰 2013春 λDNA分子具有两个cos位点， Ter体系发生作用的条件 两个cos位点之间的距离38～54kb 采用柯斯质粒作载体的困难！！ ①　载体自身只相当于可以插入片段的1/10左右，常出现载体与载体连接 用碱性磷酸酶处理，可阻止载体分子自身连接 ②大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子 选出30～45kb的外源DNA插入载体DNA，每个载体只可能插入一个外源片段 如果二个片段，则将超过包装成噬菌体颗粒的限度 ③　细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯斯质粒制备基因文库，则筛选所需的含某一DNA片段的菌落很费时间。 现虽建立了高密度菌落筛选法，但由于柯斯质粒制成的基因文库常常不太稳定，插入的大片段外源DNA有可能通过同宿主基因组交换而致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体。 3　单链DNA噬菌体载体 (M13) M13噬菌体载体是一种含单键（+）DNA（ssDNA）的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb。 用来获得大量的单链DNA片段，用于测定DNA序列、基因的定点突变研究、异源双链DNA的分析等。 2700个外壳蛋白分子 M13噬菌体载体体形图 M13单链DNA噬菌体的生命周期 Phage M13 replication in the host cell: + RNA pol DNA polIII ± RF Nicked by gene 2 protein + ss-Rolling circle replication, then cut and ligate Coated with gene 5 protein Gene 5 protein is replaced by gene 8 protein ect. Linear M13 phage released from the cell. M13 DNA载体的构建： III VI I IV II X V VII IX VIII 野生型M13RF-DNA III VI I IV II X V VII IX VIII M13mp系列载体 lacZ′ polylinker M13克隆载体MCS与分子结构图 M13 DNA载体的特点： 使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外 这在DNA定向突变中非常有用 M13重组分子筛选简便 被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混 浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊 斑的混浊度亦越大 但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5 kb 第3节　植物基因工程载体Ti 质粒 YEP培养基上的根瘤农杆菌 LB培养基上的大肠杆菌 几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部常常会形成根瘤，这是由于植物根部被一种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌（A.tumefaciens）感染所致，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒 Ti（Tumor-inducing）介导的。 Ti 质粒的结构与功能 Ti 质粒的结构与功能 Ti 质粒的图谱 整个质粒 160 - 240 kb 其中 T-DNA 12 - 24 kb tms 的编码产物负责： 合成吲哚乙酸 tmr 的编码产物负责： 合成植物分裂素 tmt 的编码产物负责： 合成氨基酸衍生物 冠瘿碱 ②　cⅠ基因 ? cⅠ编码的λ抑制子与操纵区 OR1 和OR2发生亲和作用结合后，激活PRM启动 cⅠ 表达λ抑制子，结合Cro及下游裂解蛋白基因的表达，抑制裂解生长 溶原 裂解 ??? hfl-的 E.coli 中，cⅠ 的表达使 λ 噬菌体进入溶源状态 hfl+的 E.coli 中，λ噬菌体可高效率地进入溶源状态 Hfl：高频溶源化， high frequency of lysogenization ?重组子中外源基因插入到cⅠ 中，cⅠ不能表达,将高频率地使 hfl -E.coli 进入裂解生长状态，长出噬菌斑。 在构建基因文库时，可提高排除非重组噬菌体的效率，从而降低对基因文库进行筛选的劳动强度。 Some of phage plaque ③　c Ⅱ基因 在hfl－ E.coli中增加基因 cⅠ 的产物，高效地进入溶源状态 cⅡ产物(cⅡ)结合PRE激活cⅠ的表达，生长向溶原方向进行 ?重组子中外源基因插入到cⅡ 中，cⅠ不能表达，将高频率地使 hfl -E.coli 进入裂解生长状态，长出噬菌斑。 ④　Spi 筛选 野生型 λ 噬菌体在带有 P2 原噬菌体的溶源性 E.coli 中 的生长会受到限制的表型，称作 Spi+ ，即对 P2 噬菌体的干