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基因工程技术 第三章 基因工程的常用载体 （二）质 粒 质粒是细菌或细胞染色体外，小型共价闭合环状双链DNA (cccDNA)分子，是能够独立复制并保持恒定遗传的复制子。与宿主共存的遗传单位。 细胞内独立的能够自我增殖的结构单位为复制子； 包括与复制控制有关的结构和与复制控制无关的 结构； 细菌的染色体是一个复制子，而真核生物染色体是 多个复制子的复合体。 可自然形成超螺旋，大小在2-300kb。还有开环（ocDNA）和线状两种状态。 质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用（不同于线粒体）。 是基因工程最常用的运载体。 2、质粒的种类 接合或非接合转移性质粒； 复制基因和转移基因位于R-因子的一处，耐药基因位于另一处。 RTF 区(耐药性转移因子) 带有转移基因. R 决定区 带有耐药性基因（常是转座子的成分） 抗药性包括：氯霉素（Cm），氨苄（Ap） 氯霉素（Cm）；卡那（Km）；链霉素（Sm） 对金属离子抗性 砷（As3+），汞（Hg2+），镍（Ni2+）银（Ag+） （1）自主复制性 是能独立复制的复制子。质粒DNA复制的质粒可随宿主的分裂传给下一代。 根据复制的控制和每个细胞中的拷贝数多寡，质粒可分为两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒（stringent plasmid ）：复制与宿主的繁殖相耦联，受寄主复制起始蛋白控制， 1 - 3 拷贝 松弛型复制控制的质粒（relax plasmid ）： 复制不与宿主的繁殖相耦联，几十至几百拷贝 （3）不相容性 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。 两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，在复制和分配到子细胞时存在竞争，致使两种质粒的最终拷贝数不同。 两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。 革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： 接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如含F因子质粒等； 非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用； 目前在基因工程实验室中常用的质粒属于此类。 质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，常见性状包括： 抗生素抗性（如 抗四环素、Amp、Kan） 重金属离子抗性基因、 复杂有机物的分解基因?。 它们通常是宿主细胞生长所非需的。 颜色反应（如蓝白筛选） 双向复制 4、质粒改造构建 天然质粒往往存在不同程度的缺陷，因而不适合用作 基因工程的载体必须对之进行改造构建： ? （1）具有复制起始点 具有复制子的功能，且起始区域没有所需的酶切位点。 （2）加入合适的选择标记基因 如两个以上，易于用作选择。 （3）增加或减少合适的酶切位点，便于重组 （4） 分子量尽可能小 缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率， 增加装载量 （5） 改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝 （6） 应为非传递性质粒 5、质粒的分类 人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类： 高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因 拷贝数1000-3000 扩增基因 低拷贝质粒 来自pSC101 拷贝数小于10 表达某些毒性基因 测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker 整合质粒 装有整合促进基因及位点便于外源基因的整合 穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子便于基因克隆 表达质粒 装有强化外源基因表达的转录翻译、纯化的元件 探针质粒 装有报告基因，便于启动子等元件的克隆筛选 6、实验室常用质粒 蓝白筛选原理 β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性