基因工程原理与时技术-植物基因工程.ppt

2、提高外源基因表达水平的策略 ①启动子的选择和改造； 组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子 人工杂合启动子 ②利用增强子序列； ③利用真核基因的翻译调控序列； 如：5’端Ω因子、 kozak序列、 3’端poly(A)信号序列、内含子等 ④利用定位信号序列； 如：内质网定位信号 KDEL的编码序列 ⑤叶绿体转化。 a、叶绿体DNA拷贝数多；b、具原核表达方式，可直接表达来自原核生物的基因；c、能以多顺反子的形式表达多个基因。 二、外源基因表达的检测 Northern杂交、RT-PCR、酶联免疫吸附分析(ELISA)、Western杂交、报告基因检测法。 1、gus基因的检测 底物：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D葡萄糖苷酸酯(X-Gluc) 组织化学法、分光光度法、荧光法 2、NPT-II基因的检测 底物：[γ-32P]ATP 凝胶原位检测法、点渍法、层析法 3、荧光素酶基因的检测 底物：荧光素 荧光分光光度法、荧光显微镜法 4、胭脂碱和章鱼碱的检测 纸电泳分析法 菲醌(荧光染料)染色 5、cat基因的检测 底物：乙酰CoA、氯霉素 分光光度计法 6、pat基因的检测 PPT乙酰转移酶 底物：乙酰CoA、PPT 分光光度计法 三、外源基因的遗传特性 1、外源基因的遗传稳定性 一旦外源基因整合，就随植物基因组而稳定遗传。 但也会发生外源基因丢失。其原因是：①转基因植株是嵌合体；②减数分裂同源染色体对等交换；③有丝分裂的同源重组和基因重排；④外源基因整合在细胞器基因组中，在随后的细胞质分裂中丢失。 2、外源基因的遗传规律 孟德尔式遗传 单拷贝整合 多拷贝整合 第四节 植物基因工程的应用 一、植物基因工程在植物分子生物学研究中的应用 1、转座子标签法 玉米的Ac/Ds、En/Spm和金鱼草的Tam转座子系统 Ds 农杆菌介导转化 Ac 转Ac植株 转Ds植株 Ac/Ds植株 从F2代筛选Ds插入目标突变植株 自交 突变植株基因组文库 突变基因克隆 以Ds制备探针筛选文库 野生型植株基因组文库 以突变基因制备探针筛选文库 目标基因 2、T-DNA标签法 野生型植株 T-DNA插入突变植株 农杆菌 转化 突变植株基因组文库 以T-DNA制备 探针筛选文库 突变基因克隆 野生型植株基因组文库 以突变基因制备探针筛选文库 目标基因 3、反义RNA技术 反义RNA技术是指将某反义基因转入植物而抑制其相应内源基因表达的技术。 原理：反义RNA与内源目标RNA互补结合形成稳定的双链，从而影响RNA加工和翻译，导致基因表达被抑制。 转查尔酮合成酶反义基因的矮牵牛，开白色花。 4、位点特异性重组技术 Cre/loxP 位点特异重组系统 应用：①删除转基因植株的选择标记 NPT II 目的基因 引入Cre酶 (与cre植株杂交) 目的基因 ②基因敲除 ③转基因的活化 (与特异表达Cre酶的转基因植株杂交) 二、改良植物品种 基因工程育种的优势： ①目的性强； ②育种周期短； ③打破物种界限，扩大育种基因资源库。 1、抗虫转基因植物 Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因(豇豆胰蛋白酶抑制剂)、淀粉酶抑制剂基因(菜豆淀粉酶抑制剂基因)、植物凝集素基因(雪莲花凝集素基因)、昆虫特异性神经毒素基因 防止或延缓害虫产生耐受性的方法： ①采用特异性的启动子，使目的基因在适当的时间和特定的组织进行表达；②在同一植物中转入两种以上抗虫基因；③在种植模式上控制昆虫的抗性。 2、抗病转基因植物 ①抗病毒病转基因植物 病毒外壳蛋白基因、病毒卫星RNA、病毒复制酶突变基因、病毒反义RNA基因 ②抗真菌病转基因植物 几丁质酶基因、葡聚糖酶基因、核糖体失活蛋白基因、PR基因、植物抗真菌蛋白基因 ③抗细菌病转基因植物 溶菌酶基因、抗菌肽基因、植物抗病基因(Xa21) 3、抗除草剂转基因植物 抗除草剂基因工程的策略： ①过量表达靶标酶或靶标蛋白质，使作物吸收除草剂后，仍能进行正常代谢作用；②导入除草剂不敏感靶标酶或蛋白的