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遗传学实验 山东大学 生命科学学院 13 级临八 模式植物拟南芥T-DNA 插入突变体的鉴定 摘要 当农杆菌侵染植物细胞时，土壤农杆菌的天然质粒—Ti 质粒上T-DNA 区段能自发转 移进植物细胞，并插入染色体DNA 中。拟南芥的T-DNA 插入变异是反向遗传学进行植物生 物学研究的重要手段之一，在获得的Ti 质粒转化植物细胞后代分离群体中，有T-DNA 插入 的纯合突变体，杂合突变体，和野生型，在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所 以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。本实验以拟南芥植株的特定基因突变体作为 实验材料，提取DNA，并通过PCR 扩增及SDS电泳分离检测鉴定，检测该拟南芥是否 为转基因的拟南芥，并判断其是纯合突变还是杂合突变。本次实验目的在于了解拟南芥 T-DNA 插入突变体鉴定的原理，掌握DNA 提取技术、PCR 技术以及电泳鉴定技术，对拟南芥 的基因型做出判断。 关键词 T-DNA 插入突变体 拟南芥 PCR 琼脂糖凝胶电泳 1. 引言 1.1 遗传研究途径 （1）正向遗传学研究 杂交或诱变→表型观察→遗传规律→确定存在的基因及数目→基因的功能及作用性 质。 （2）反向遗传学研究 在已知DNA 序列的基础上，通过DNA 重组、定点突变、插入/缺失等遗传修饰手段创 造突变体并研究突变所造成的表型效应，从而研究基因的生物学功能，阐明生命的本 质现象与规律。拟南芥的T-DNA 插入变异是反向遗传学进行植物生物学研究的重要手 段之一。 1.2 模式生物——拟南芥 拟南芥广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式 植物，其原因主要基于该植物具有以下特点： ①植株形态个体小，高度只有30cm 左右，1 个茶杯可种植好几棵； ②生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需6 周左右； ③种子多，每株每代可产生数千粒种子； ④形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养； ⑤基因组小，只有5 对染色体； ⑥拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，容易获得各种 代谢功能的缺陷型。 拟南芥全部基因组测序已经完成，每个单倍染色 体组（n=5）的总长只有7000 万个碱基对（只有小麦 染色体组长的1/80），预测共有29,454 个基因。这样 科学家就可以准确定位插入DNA 的位置。 1.3 Ti 质粒和T-DNA 插入突变技术 Ti 质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一 段特殊的DNA 区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA 区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA 中。所以Ti 质粒上的这一段能转移的 遗传学实验 山东大学 生命科学学院 13 级临八 DNA 被叫做T-DNA。 T-DNA 插入基因内部导致基因突变：T-DNA 插入到植物染色体上的什么位置，是随机的。 如果T-DNA 插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。 所以利用农杆菌Ti 质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。 T-DNA 插入突变技术是反向遗传学的重要手段之一。T-DNA 能稳定地整合到植物基因组中 并稳定地表达。T-DNA 在植物中一般都以低拷贝插入，多为单拷贝。单拷贝T-DNA 一旦整合 到植物基因组中，就会表现出孟德尔遗传特性，在后代中长期稳定表达，且插入后不再移动， 便于保存。由于插入的T-DNA 序列是已知的，因此可以通过已知的外源基因序列，利用反向 PCR、TAIL-PCR、质粒挽救等方法对突变基因进行克隆和序列分析，并对比突变的表型研究 基因的功能。还可以利用扩增出的插入位点的侧翼序列，建立侧翼序列数据库，对基因进行 更全面的分析。由此可见，T-DNA 插入标签技术已成为发现新基因、鉴定基因功能的一种重 要手段。 T-DNA 插入突变技术应用：⑴获得转基因植株⑵引起基因失活，产生基因敲除突变体。 1.4 植物基因组DNA 提取 提取植物基因组 DNA 的原理：液氮研磨植物组织破壁 去污剂（CTAB ）裂解细胞膜， 变性蛋白 释放DNA 氯仿—异戊醇除去变性蛋白质 乙醇或异丙醇沉淀DNA。 CTAB 的主