曹珊读书报告2008.11.17.pptVIP

我国虫草属真菌研究开发的现状 报告人：曹珊 2008.11.17 1 虫草无性型的分离与确证 2 虫草生物学、生理学及遗传育种研究 3 虫草资源的应用价值评估 4 对今后研究开发的思考 1 虫草无性型的分离与确证 　 目前,全球已发现的虫草属菌种有400 多种,我国已报道的有100 种左右。虫草属真菌具有抗肿瘤、抗病原、抗氧化、增强人体免疫功能等多种生理活性。迄今为止,虫草属真菌在药理作用、有效成分和人工培养等方面的应用研究取得了一定的进展。 近年来,国内外人工培养虫草,特别是冬虫夏草已成为一个热点问题。人工培养虫草面临的首要问题就是菌种(虫草无性型) 的分离。但是,在这样多的冬虫夏草菌种中,哪一种是真正的无性型?如何正确确定虫草的无性型,这不仅是冬虫夏草开发中的现实问题,也是要不要把虫草作为一类可再生的生物资源来研究和利用的关键。 1. 1 　多途径多批次分离确定 此法简便易行,能及时分离到很易失去生存力的虫草菌种,是随后确证虫草无性型研究工作的基础。但此法难以排除获得的是互生、伴生、混合感染和重寄生菌等非真正虫草无性型菌株的可能性。故需要用其它方法对获得的假定无性型作进一步确证。 1. 2 　微循环产孢直接确证 　 在特定条件下，真菌的孢子(有性或无性孢子) 萌发后无营养菌丝生长阶段(或仅有极少量的菌丝生长) 就直接重复产孢的现象称为微循环产孢(Microcycle conidiation)。大多数虫草子囊孢子在一定条件下都能直接萌发进行微循环产孢，形成具有鉴别特征的无性产孢结构。在采集虫草标本时，将诱发子囊孢子微循环产孢并与同时进行的多途径多批次分离培养的菌株产孢结构相比较，就可快速、直观、可靠地确定一种虫草的无性型。 1. 3 　在特定人工培养基上诱发虫草有性子实体的确定 　 将组织和子囊孢子分离所得的培养物进行人工培养诱发出有性型子实体，而后经切片观察,确定与野外采集标本有性产孢结构的同一性，以确证分离培养物为其无性型。此法最具权威性，但有不少虫草种目前很难人工培养出子实体。 1.4 现代分子生物学技术 应用RAPD-PCR的分子生物学的方法可以为确定虫草的无性型提供可靠的分子生物学证据。其程序是首先分别提取虫草子座和假定无性型的DNA, 再筛选出合适的引物进行PCR扩增, 得到相应的基因组DNA指纹图谱；如果两者的指纹图谱相似率很高（在90%以上）, 就可确定分离获得的假定无性型是实际的无性型。此外, 用保守的引物ITS1,ITS4对rDNA的区域进行PCR扩增, 产物经纯化后, 对ITS进行测序,比较两者碱基序列的相似性, 也可确定虫草的无性型。 2 虫草生物学、生理学及遗传育种研究 2. 1 　虫草子囊孢子的阶段发育 　 虫草种主要以子囊上部、子囊孢子和次生子囊孢子的形状及大小等微观特征进行鉴别。而某一鉴定者描述鉴定的某一种虫草,都只是反映了该种虫草一个特定的生长发育阶段的特征。因而,同一种虫草不同生长发育阶段的标本,完全可能被不同的真菌学工作者鉴定为不同的虫草。 冬虫夏草子囊孢子发育过程中,在原子囊孢子期、子囊孢子伸长期和子囊孢子成熟期三个阶段,它们在形态特征和大小上存在明显的差别。因此,对虫草种的鉴定,很有必要从子囊孢子发育的动态过程,全面认识和掌握子囊孢子的形状和大小这一微观的鉴别特征。在实际鉴定工作中,应以诱导发射的子囊孢子作为形态、大小的描述和测定的依据。 2. 2 　多型现象 　 与分类鉴定和应用研究密切相关的另一重要基础问题是虫草无性型的形态、生理和遗传上的多样性。研究发现,蛹虫草无性型蛹草拟青霉( P. militaris) 在单孢子株水平上的菌落特征、基质菌丝形态、产孢结构、有性子实体形成能力、nit 突变株的类型、营养亲和性分群、核相变化以及常温下存活时间等形态、生理和遗传特性方面都有较大的差异。因此判明，出现在蛹虫草无性型中的几个同物异名, 完全是不同研究者对蛹虫草无性型多型现象不同产孢结构特征的观察结果。 观察、研究、分析虫草无性型多型现象,对正确确定虫草的真正无性型具有重要的指导意义。这对其他相似半知菌的正确分类鉴定也有参考价值。 2. 3 　虫草人工培养 虫草真菌具有很大的药用价值，因此虫草人工培养对虫草类真菌的科学研究和生产应用具有重要意义。 由于人工培育冬虫夏草子实体难度大，许多单位和人员在虫草的菌丝体研究做了大量的工作。人工培养的虫草菌丝体的大多成分、理化性质及药理作用与冬虫夏草相似