HPPRRSV疫苗株HuN4F112感PAM效率降低的分子机理的研究.docx

Classified Classified Index： Code：10224 Confidential(yes／no)：rio N0．110038 Dissertation for the Doctoral Degree Identification the Main Gene Determing the Infectivity of HP-PRRSV HuN4—-FI I 2 Strain on PAMs in Vivo Candidate：Chen Jiazeng Supervisor：Tong Guangzhi Degree Category：Doctor ofAgriculture College：College of Veterinary Medicine First level discipline：Veterinary Medicine Second level discipline：Preventive Veterinary Medicine Harbin China December 2014 万方数据 目 目 录 目 录 中文摘要 ·I 英文摘要 ·V 1前言 ．．1 1．1 PRRSV的基因组结构 ．．2 1．2 PRRSV的非结构蛋白及其功能 2 1．2．1动脉炎的NSPl：具有自切割活性参与不同阶段的复制周期 3 1．2．2非结构蛋白NSP2 ．．7 1．2．3主要蛋白酶NSP4 ··8 1．2．4动脉炎病毒RNA合成中的关键酶：RdRp蛋白NSP9和解旋酶NSPl0 ··9 1．2．5核糖核酸内切酶NSPll：在动脉炎病毒中发现的一个潜在的“自杀酶” -·9 1．2．6与非结构蛋白相关的特殊结构和功能 ．10 1．2．7其他非结构蛋白及功能 12 1．3结构蛋白及其功能 ．-13 1．3．1主要结构蛋白 14 1．3．2次要结构蛋白 15 1．3．3与结构蛋白相关的病毒侵入 17 1．4 PRRSV亟待解决的争议 ．18 1．4．1 PRRSV免疫逃逸机制 18 1．4．2抗体依赖性增强(ADE) 18 1．4-3持续感染 19 1．4．4中和抗体 19 1．4．5毒力基因 20 1．4．6存储和复制的组织 20 1．5本研究的目的与意义 ．．21 2材料与方法 ．22 2．1材料 ．22 2．1．1主要试剂 22 2．1．2主要仪器设备 22 2．1．3细胞、毒株、质粒和菌株 22 2．1．4实验动物 23 2．2方法 ． 23 2．2．1影响疫苗株对PAM感染效率的关键ORF的确定 ．23 2．2．2关键基因区域的确定 25 2．2．3重组NSP2基因的嵌合病毒的构建及拯救 ．30 2．2．4 NSP2蛋白上关键氨基酸的鉴定 ．．32 万方数据 东北农业大学农学博士学位论文2．2．5 东北农业大学农学博士学位论文 2．2．5 NSP2作用机理的探索 ．．33 2．2．6 HP．PRRSV疫苗株体内储存器官的确定 ．34 3结果 - 36 3．1影响病毒感染PAM效率的关键ORF的鉴定 ．．36 3．1．1病毒拷贝密度的检测 36 3．1．2流式细胞术检测结果 36 3．2关键基因区域的确定 ．．37 3．2．1嵌合病毒的拯救及鉴定 37 3．2．2嵌合病毒毒价测定 40 3．2．3病毒生长曲线的测定 40 3．2．4各基因替换后对病毒感染PAM效率的影响 ．．4l 3．3关键基因NSP2的确定 ．．42 3．3．1互换NSP2基因的感染性克隆构建及拯救 ．42 3．3．2结果判定 44 3．4关键基因作用机理的揭示 --44 3．4．1病毒接种量的确定 44 3．4．2疫苗株侵入宿主和RNA合成的能力的影响 ··45 3．4．3关键基因对病毒蛋白合成的影响 ．46 3．5关键氨基酸的确定 ··47 3．6PRRSV在猪体内分布器官的鉴定 -·48 3．6．1血清病毒分离结果 49 3．6．2剖检结果 49 3．6．3各组织细胞被感染的比例分析 49 4讨j沦 -56 4．1关键基因鉴定的意义 ··56 4．2关键基因NSP2的功能 ··58 4．3鉴定PRRSV在体内分布的意义 59 5结论 · ·· ·62 致谢 ·63 参考文献 ·64 攻读博士学位期间发表的学术论文 ·80 万方数据 CoNTENTSAbstract CoNTENTS Abstract in Chinese·········-···············-········--························-·······--···--·········‘’。。’I AbstractinEnglish · ····- ··’·········· ’‘‘‘