富含亮氨酸的三角状五肽重复结构蛋白对自噬的调节及其机制的分析-外科学专业论文.docx

摘要 摘要 PAGE PAGE IV 第 2 部分 LRPPRC 对线粒体自噬的影响 目的：研究 LRPPRC 表达被抑制后细胞中线粒体以及线粒体自噬的改变情 况。 方法：在 HeLa 细胞中转染 LRPPRC siRAN 抑制细胞 LRPPRC 表达含量。 利用 Mitotracker 对细胞线粒体染色以及免疫荧光对 cytochrome c 染色的方法比 较正常细胞与 LRPPRC 表达抑制 HeLa 细胞中线粒体电位情况。使用 Tom20 标 记线粒体，并采用免疫荧光、免疫印迹方法比较有或无溶酶体处理的正常 HeLa 细胞、LRPPRC 表达抑制 HeLa 细胞中线粒体总量。还应用免疫荧光双染色法 对 比 研 究 有 或 无 溶 酶 体 处 理 的 HeLa-GFP-LC3 细 胞 、 LRPPRC 表 达 抑 制 的 HeLa-GFP-LC3 细胞中，Tom20 标记的线粒体与 LAMP1/2 标记的溶酶体或 LC3 标记的自噬小体的共定位情况。 结 果 ： LRPPRC 被 抑 制 表 达 后 ， HeLa 细 胞 内 Mitotracker 荧 光 减 弱 、 cytochrome c 荧光与免疫印迹检测的蛋白含量均下降。未使用溶酶体抑制剂 时，LRPPRC 抑制细胞中 Tom20 标记的线粒体与 GFP-LC3 的共定位、Tom20 的总量都比正常细胞少。在使用了溶酶体抑制剂后，LRPPRC 被抑制细胞中 Tom20 标记的线粒体与 GFP-LC3 的共定位比 LRPPRC 未被抑制的细胞多，且 两种细胞中 Tom20 的总量相同。在使用了溶酶体抑制剂后，LRPPRC 被抑制细 胞中 Tom20 标记的线粒体与 LAMP1/2 标记的溶酶体或 LC3 标记的自噬小体的 共定位均多于 LRPPRC 未被抑制的细胞。 结论 ：LRPPRC 可以维持线粒体电位稳定，并且抑制 LRPPRC 的表达导致 线粒体自噬的激活。 关键词：线粒体；线粒体自噬；线粒体电位；自噬小体；溶酶体 PAGE PAGE V 第 3 部分 LRPPRC 在线粒体自噬中调节机制的研究 目的：研究 LRPPRC 在线粒体自噬过程中发挥的作用，以及 LRPPRC 与线 粒体自噬调节信号通路 PINK1/Parkin 间的相互关系。 方法： 采用 CCCP（10μM）或 6-OHDA（100μM）处理细胞，建立线粒体 自噬的细胞模型。HEK-293T 细胞在 CCCP 或 6-OHDA 处理后，应用免疫印迹 方法检测不同时间点有或无溶酶体抑制剂处理的细胞中自噬相关蛋白 ATG5- 12、LC3、Bcl-2、P27 以及 LRPPRC 的蛋白水平，并通过电子显微镜观测这些 细胞中线粒体的形态与数量。利用免疫共沉淀方法对比检测 HEK-293T 细胞有 或无 CCCP 处理时细胞中内源性 LRPPRC 与内源性 Parkin 的相互关系。并且在 HeLa 细胞中转染 GFP-Parkin 质粒后，通过免疫荧光双染法与免疫共沉淀方法 对比检测有或无 CCCP 处理的细胞中内源性 LRPPRC 与外源性 GFP-Parkin 的相 互关系。在 HeLa 细胞中过表达 RFP-LC3，并筛选稳定表达（HeLa-RFP-LC3） 细胞株。为了明确 LRPPRC 在线粒体自噬中的作用使用 CCCP 处理转染 GFP- Parkin 质粒的 HeLa-RFP-LC3 细胞，采用免疫荧光方法观察不同时间点时细胞 内 GFP-Parkin、LRPPRC、RFP-LC3、LAMP2 标记的溶酶体、Tom20 标记的线 粒体之间的共定位现象。在 HEK-293T 细胞中转染 Parkin siRNA 或 HeLa 细胞 Parkin-GFP 质粒，以及在 GFP-Parkin 质粒转染的 HeLa 细胞中使用 CCCP 处理 不同时间，用免疫印迹的方法比较 HEK-293T 细胞、HeLa 细胞中 Parkin 蛋白水 平的变化对 LRPPRC 的影响以及比较表达 Parkin-GFP 与 GFP 的 HeLa 细胞中 CCCP 处理不同时间后 Tom20、LRPPRC 蛋白水平的变化。在 HeLa 细胞中采 用转染 LRPPRC siRNA，或在 COS7 细胞中转染 GFP-LRPPRC 质粒，达到调节 细胞中 LRPPRC 的水平。在过表达 GFP-LRPPRC 和 GFP 的细胞（对照细胞） 内 加 入 蛋 白 合 成 抑 制 剂 CHX ， 以 及 在 CHX 处 理 不 同 时 间 后 这 两 种 细 胞 中 Parkin 蛋白的变化。同样，使用免疫印迹比较细胞中 LRPPRC 蛋白水平的变化 后 在 有 或 无 CCCP 处 理 的 细 胞 中 线