复方灯盏花滴丸对H2O2致PC12细胞损伤的保护作用研究-药理学专业论文.docxVIP

贵阳医 贵阳医学院 2012 届硕士研究生论文 PAGE PAGE 1 复方灯盏花滴丸对 H2O2 致 PC12 细胞损伤的保护作用研究 专 业 名 称：药理学 研究生：徐菁霞 导师：宛蕾教授 摘 要 目的 研究复方灯盏花滴丸对氧化应激致大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞（PC12 细胞）损 伤的保护作用，并探讨其可能的作用机制。方法 培养 PC12 细胞，实验分为 6 组：空白对照组，氧化损伤组（模型组），复方灯盏花滴丸不同浓度组（0.763μg/mL、 3.052μg/mL、12.207μg/mL），阳性药组（维生素 E 4.307μg/mL），药物干预 24h 后，除空白对照组外，其余各细胞组用 300μmol/L 过氧化氢（H2O2）诱导 PC12 细胞损伤 2h，进行相关指标检测：（1）倒置显微镜下细胞形态学观察；（2） 线粒体琥珀酸脱氢酶（MTT）检测细胞存活率；（3）光化学法测定细胞乳酸脱 氢酶（LDH）释放的测定；（4）黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶（SOD） 活性以及硫代巴比妥法测定丙二醛（MDA）含量；（5）一氧化氮(NO)含量检测 以及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）活性测定；（6）Annexin V-FITC/PI 双染法测 细胞凋亡率；（7）免疫细胞化学法测定细胞色素 C 含量；（8）免疫细胞化学 法测定 caspase-3 蛋白的表达。结果 300μmol/L 的 H2O2 损伤细胞 2h 可明显降低 PC12 细胞的增殖活性，增加 LDH 的外漏，提高细胞内 MDA 含量，降低 SOD 活性，增高 NO 含量，提高 iNOS 活性，增加细胞色素 C 的释放，提高 caspase-3 的表达，引起细胞凋亡，与空白对照组比较有统计学差异（P＜0.05），表明 H2O2 所致 PC12 细胞损伤模型复制成功；不同浓度的复方灯盏花滴丸可提高 PC12 的 MTT 吸光度值，减少细胞内 LDH 的外漏，减少 MDA 产生，增强 SOD 活性， 减少 NO 的产生及降低 iNOS 活性，减少细胞色素 C 的释放，减少 caspase-3 的 表达，抑制细胞凋亡，与模型组比较有显著性差异（P＜0.01）。 结论 复方灯 盏花滴丸可对过氧化氢所致的 PC12 细胞的损伤有保护作用，能提高 PC12 细胞 的存活率及改善其形态，减少氧化损伤、细胞凋亡， 其作用机制可能包括：（1） 稳定细胞膜；（2）增加清除氧自由基的能力，提高抗脂质过氧化能力；（3）减 少 NO 的产生及抑制 iNOS 的活性；（4）减少细胞色素 C 的释放，抑制 caspase-3 的表达，干扰线粒体细胞凋亡信号转导途径从而抑制细胞凋亡。 关键词 复方灯盏花滴丸； PC12 细胞；氧化应激；细胞凋亡； 细胞色素 C； caspase-3； 前 言 神经系统疾病特别是脑血管病已成为危害人们健康的主要疾病之一，患病率 在不断上升，严重影响着人类的健康，降低生活质量，已日益引起了人们高度重 视。 近年来的研究发现，氧化应激参与许多中枢神经系统疾病的发生，如脑缺血， 脑肿瘤，脑外伤，神经退行性疾病等。氧化应激学说在缺血性脑血管疾病缺血再 灌注病理机制中起关键作用[1]。在这些病理状态下，可产生大量的氧自由基，并 引起机体自稳机制紊乱，导致细胞损伤甚至死亡。氧化还原反应是体内代谢的基 本反应，反应过程会产生大量的氧自由基，在生命活动中起着重要的作用。在正 常的生理条件下，体内不断地产生氧自由基的同时，体内又有一套有效的机制不 断地清除氧自由基，始终使氧自由基的浓度维持在无害的低水平平衡状态。但当 氧自由基的产生量超过了体内清除的能力，则会对机体造成严重的损害。活性氧 （reactive oxygen species，ROS）是指一组含有化学性质活泼的含氧功能基团的 化合物，包括含氧自由基、氢过氧化物、脂质过氧化物、环氧代谢物等。对于神 经细胞而言，诱发其凋亡的机制复杂，其中活性氧自由基通过引起细胞脂质过氧 化、损伤DNA分子或者调节细胞凋亡相关基因而诱导细胞凋亡[2]。我国中药资源 丰富，如能寻找到改善神经细胞的损伤的药物，将对其相关疾病的防治及人类的 健康做出巨大的贡献。 PC12 细胞株来源于大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤，能够分泌多巴胺和表达多 巴胺转运体，因而广泛应用于神经系统疾病的体外研究。PC12 细胞的重要生物 学特征之一是对神经生长因子（NGF）能产生反应，能被 NGF 诱导分化后表现 出交感神经元的特有的生物性质，长出神经突起，具有电兴奋性，并有许多与神 经细胞分化有关的组分改变，细胞膜片钳、PCR 及免疫印记等技术检测到经 NGF 诱导分化后的 PC12 细胞，其功能性 NMDA 受体表达明显增加，对谷氨酸的亲 和力增强等，因此该细胞株广泛用于神经元