牦牛乳酸脱氢酶A的分离纯化酶学性质及其基因的克隆.PDFVIP

中国农业科学 2008,41(5):1470-1475 Scientia Agricultura Sinica 牦牛乳酸脱氢酶A的分离纯化、酶学性质及其基因的克隆 郑玉才，司晓辉，贺庆华，金素钰，洪 键 （西南民族大学生命科学与技术学院，成都 610041 ） 摘要：【目的】分离纯化牦牛骨骼肌中的乳酸脱氢酶-A（LDH-A），并克隆其 cDNA。通过比较牦牛与普通牛的 LDH-A 的酶学性质和 cDNA 序列，为研究牦牛适应高海拔、低氧环境，在分子水平上找到一些线索。【方法】采用 染料亲和层析和 DEAE-Sephadex 离子交换层析等方法，分别从牦牛和普通牛骨骼肌中纯化 LDH-A，并对其酶学性 质进行比较；通过RT-PCR方法克隆牦牛LDH-A的cDNA序列，并与GenBank 登录的普通牛LDH-A的cDNA序列进行 比对。【结果】纯化的牦牛 LDH-A 比活力为 103.9 U·mg-1 蛋白，纯化倍数为 18.2。SDS和 PAGE 分析均显示一 条带。酶动力学参数测定显示，牦牛 LDH-A 的 K NADH 为 0.097，K 丙酮酸钠为 1.897，均不同程度高于普通牛， m m 其中对丙酮酸钠的 K 大约是普通牛的2倍。根据牦牛LDH-A的cDNA序列预测的氨基酸序列与普通牛LDH-A的氨基 m 酸序列比较，只有2个氨基酸残基的改变（257Val-Ala和315Tyr-Cys）。【结论】牦牛LDH-A对丙酮酸的高K 可避 m 免骨骼肌中产生过多的乳酸，是适应进化的结果；这种升高可能与其氨基酸序列变化导致的空间结构微小改变有 关。 关键词：牦牛；乳酸脱氢酶；纯化；动力学性质；基因克隆 Purification and Property of Yak Lactate Dehydrogenase-A and Sequence of Its cDNA ZHENG Yu-cai, SI Xiao-hui, HE Qing-hua, JIN Su-yu, HONG Jian (College of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041) Abstract: 【Objective 】 In order to investigate the molecular mechanism of the ability of yak (Bos. grunniens) to adapt to high altitude and low oxygen environment, the lactate dehydrogenase A (LDH-A) from yak skeletal muscle was purified and characterized, and its cDNA was amplified, cloned and sequenced. The kinetics of the yak LDH-A and its cDNA sequence were compared with those of bovine LDH-A. 【Method 】 Dye affinity chromatography and DEAE-Sephadex ion-exchange chromatography were used to purify the LDH-A from skeletal