二烯丙基二硫下调uPAR抑制人结肠癌细胞增殖、迁移与侵袭-病理学与病理生理学专业论文.docxVIP

本研究基金资助项目 1、国家自然科学基金2、湖南省自然科学基金 07JJ3033 3、湖南省高校创新平台开放基金 09K074 4、湖南省卫生厅科研课题计划项目 B2008-067 5、湖南省教育厅科学研究重点项目 09A077 6、湖南省科技厅科技计划 2008SK3010 二烯丙基二硫下调 uPAR 抑制结肠癌细胞增殖、迁移与侵袭 中文摘要 目的：近年来，发现尿激酶型纤溶酶原激活物受体(urokinase plasminogen activator, uPAR) 参与多种肿瘤的调控，对肿瘤细胞的增殖和侵袭的意义引起了广泛关注。 我们先前证明二烯丙基二硫（diallyl disulfide，DADS）可诱导人结肠癌 SW480 细胞增殖抑制与细胞周期 G2/M 期阻滞，其机制不明。本研究旨在研究 DADS 与沉默 uPAR 基因对人结肠癌 SW480 细胞 uPAR 表达及其信号通路的影响，以 阐明其抗肿瘤细胞增殖、迁移与侵袭的分子机制。 方法：根据 uPAR 基因序列设计 miRNA1、miRNA2、miRNA3、miRNA4 干扰序 列，并设计 1 条非特异性序列作为阴性对照。将含靶向 uPAR 的 miRNA 的质粒 pcDNATM6.2-GW/EmGFpmiR-uPAR 转染人结肠癌 SW480 细胞，建立稳定细胞 系，通过 Western blot 验证其对 uPAR 表达的抑制作用；MTT 比色法检测 DADS 作用和干扰 uPAR 后的 SW480 细胞增殖的影响；Transwell 实验和划痕实验分别 观察 DADS 作用和干扰 uPAR 后 SW480 细胞侵袭和迁移能力的改变；免疫组化 检测 DADS 作用和干扰 uPAR 后的 SW480 细胞的 uPAR 的表达；RT-PCR、Western blot 分别检测 DADS 作用和干扰 uPAR 后的 SW480 细胞 uPAR 的 mRNA 与蛋白 表达。Western blot 分别检测 ERK、Fra-1、TIMP-3、MMP9、uPA 的蛋白表达； RT-PCR 分别检测 TIMP-3 和 uPA 的 mRNA 表达。RT-PCR、Western blot 分别检 测 DADS 作用 SW480 细胞 vimentin 和 E-Cadherin 的 mRNA 与蛋白表达。 结果： 1. DADS 对人结肠癌 SW480 细胞 uPAR 蛋白表达的影响 45mg·L-1 DADS 分别处理 SW480 细胞 0、12、24、48 h 后，Western blot 结 果显示，uPAR 蛋白的表达水平呈时间依赖性下降。免疫细胞化学显示，uPAR 蛋白在 DADS 处理 0h 组细胞胞膜和胞浆上表达呈强阳性，处理 12、24、48 h 后 表达明显减弱。表明 DADS 可呈时间依赖性抑制 SW480 细胞 uPAR 蛋白表达。 2. DADS 下调 uPAR 对 SW480 细胞迁移与侵袭的影响 划痕实验结果显示，DADS 处理结肠癌 SW480 细胞 0、12、24、48 h 后， 观察它们的划痕愈合情况，DADS 处理 0h 组划痕愈合显著快于 12、24、48 h 组， 证明 DADS 处理后 SW480 细胞迁移能力被抑制 (P0.05)，呈时间依赖性下降。 Transwell 实验显示，DADS 处理 SW480 细胞后的体外侵袭能力被抑制，呈时间 依赖性下降。 3. RNA 干扰 uPAR 对 DADS 抑制 SW480 细胞增殖、迁移与侵袭的影响 pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-uPAR-miRN 干扰质粒提取后琼脂糖电泳跑胶 结果表示质粒提取纯度较高，倒置荧光显微镜下可见转染细胞发绿色荧光。 Western blot 结果显示，与未转染组相比，转染 uPAR-miRNA 后 SW480 细胞 uPAR 蛋白表达降低（P0.0 5）。 Western blot 结果显示，转染 uPAR-miRNA1 的 SW480 细胞其 uPAR 蛋白表 达水平与阴性转染组相比分别下降 70.11%、18.12%、72.32%、15.32%，第 3 转 染组对蛋白表达的抑制最明显 (P0.05)。后续实验均采用 uPAR-miRNA3 质粒作 为实验对象。 绘制生长曲线表明，48h 后 uPAR 沉默组与未转染组和阴性转染组比较，细 胞增殖明显抑制 (P0.05)，而未转染组与阴性转染组相比差异无显著性意义 （P0.05）。表明沉默组较未转染组和阴性转染组生长速度减慢。MTT 结果显示， 干扰 uPAR 表达可抑制细胞增殖。DADS 处理沉默组细胞 24h 后发现，细胞增殖 抑制率明显高于 DADS 处理的未转染组