β-arrestin1与EZH2结合调控慢性粒细胞白血病增殖-临床检验诊断学专业论文.docxVIP

重庆医 重庆医科大学硕士研究生学位论文 万方数据 万方数据 英汉缩略语名词对照 英文缩写 Fugw 英文全称 non-specific-siRNA (Ctrl) 中文全称 空载质粒 Siβ1 β-Arrestin1 knockdown β-Arrestin1 基因敲除质粒 Ctrl control 对照 CML chronic myeloid leukemia 慢性粒细胞白血病 ddH2O PCR double distilled H2O polymerase chain reaction 双蒸水 聚合酶链式反应 MSP methylation specific PCR 甲基化特异 PCR Q-PCR quantitative PCR 荧光定量 PCR CHIP chromatin immunoprecipitation 染色质免疫共沉淀 mRNA messenger RNA 信使 RNA dNTP deoxynucleotides triphosphate 脱氧核糖核苷三磷酸 H4 histone H4 组蛋白 H4 cDNA complementary deoxynucleic acid 互补脱氧核糖核酸 RNA ribonucleic acid 核糖核酸 DNA deoxynucleic acid 脱氧核糖核酸 min minute 分钟 h hour 小时 s second 秒 d day 天 PBS phosphate buffered solution 磷酸盐缓冲液 1 R F reverse forward 下游引物 上游引物 rpm revolutions per minute 每分钟转数 SDS sodium dodecylsulfate 十二烷基硫酸钠 Taq AP Taq DNA polymerase Ammonium persulphate 嗜热 DNA 聚合酶 过硫酸铵 ml μl milliliter microliter 毫升 微升 μg RT microgram room temperature 微克 室温 UM M unmethylative primer methylative primer 非甲基化引物 甲基化引物 IP IB immunoprecipitation Western blot 免疫沉淀反应 免疫印迹 2 β-arrestin1 与 EZH2 结合调控 慢性粒细胞白血病增殖 摘 要 目的 在我们的前期研究中，发现 β-arrestin1 通过影响基因组的表观遗传 学改变，来促进体内外 CML 细胞的增殖。本研究的主要目的旨在寻找 β-arrestin1 是怎样通过影响基因的表观遗传学修饰进而调控 CML 增 殖，为寻找针对 CML 的分子机制，及可能的潜在治疗分子靶点提供新 的科学依据。 方法 1. 利用前期研究中采用的对照质粒 Fugw（Ctrl）及抑制 β-arrestin1 (siβ1) 慢病毒体系感染 CML K562 细胞，利用有限稀释法进行稳定筛 选 K562-Ctrl 和 K562- siβ1 细胞。 2. 采用 Westren blot，免疫共沉淀技术（Co-IP）及免疫荧光激光共 聚焦技术分别检测 K562-Ctrl 和 K562- siβ1 细胞中 EZH2 蛋白的表达， 比较 β-arrestin1 与 EZH2 的结合与在细胞中定位的差异。 3. 利用 EZH2 抑制剂 3-deazaneplanocinA (DZNep) 2μm 处理 K562-Ctrl 细胞 48h，分别采用 Co-IP 技术检测对 β-arrestin1 与 EZH2 本课题受重庆市杰出青年基金资助（CSTC，2010B。 3 结合的影响；利用甲基化特异 PCR（MSP）和染色质免疫共沉淀（ChIP） 技术来检测 P15、P16、和 PTEN 等抑癌基因的表观遗传学变化；利用 RT-PCR 检测抑癌基因的表达变化。 4. 利用 EZH2 抑制剂 DZNep 处理 K562-Ctrl 细胞和 CML 模型鼠通 过克隆形成实验，老鼠生存曲线的观察来分析对体内外 CML 增殖的影 响 结果 1. 稳定筛选的 CML K562-Ctrl 和 K562-siβ1 细胞中，EZH2 蛋白表 达无差异，即抑制 K562 细胞中 β-arrestin1 表达，不影响 EZH2 蛋白的 表达。 2. Co-IP 和免疫荧光共聚焦显微镜技术均显示在 K562-Ctrl 和 K562-siβ1 细胞中 β-arrestin1 与 EZH2 结合与共定位在细胞核内。在 K562-siβ1 细胞中，β-arrestin1-EZH2 结合明显弱于在 K562-Ctrl 细