WRAP53在食管鳞状细胞癌中的表达及其作用机制的初步研究-生物化学与分子生物学专业论文.docx

汕头 汕头大学医学院博士学位论文 I万方数据 I 万方数据 中 文 摘 要 目的: 食管鳞状细胞癌恶性度高、预后差，食管癌发生、发展根本的分子生物学机制尚不 清楚。近年来 WRAP53(也被称为 TCAB1 或 WDR79)作为肿瘤抑制基因 p53 的反义基因 引起人们的广泛注意。最初对于 WRAP53 的研究集中于其转录本对于正义基因 p53 转 录本的正向调控机制，同时证明了 WRAP53 敲除抑制 DNA 损害时 P53 的诱导。最近的 研究则集中于其所编码的蛋白质的功能。WRAP53 蛋白质是活性端粒酶蛋白的新成员， 对端粒酶全酶的组装、在 Cajal 小体的累积以及行使功能以确保端粒的延长都是必须的。 WRAP53 蛋白能通过增加染色体末端端粒的长度促进祖细胞和肿瘤细胞的增殖，促进多 种癌细胞的生存。但 WRAP53 mRNA 和蛋白在食管癌肿瘤组织中的表达及功能状态尚 未见报道，本研究的目的致力于阐明食管鳞状细胞癌肿瘤组织中 WRAP53mRNA 和蛋白 的表达差异及其与食管鳞状细胞癌患者临床病理参数之间的关系，并对 WRAP53 表达 下调对食管鳞状细胞癌细胞株的增殖和凋亡的影响做一初步研究。 方法: 1. 运用免疫印迹法和实时定量 PCR 技术分别检测食管鳞状细胞癌细胞系(EC109， EC9706，KYSE150 和 KYSE180)、45 对食管鳞状细胞癌组织和癌周正常食管粘膜 上皮组织中 WRAP53 蛋白及 WRAP53 mRNA 的表达。 2. 用免疫组织化学染色法对 115 例食管癌患者的食管鳞状细胞癌组织和 85 例癌周正常 食管粘膜上皮组织（前面 45 对组织包括在内）中的 WRAP53 蛋白的表达进行半定 量测定，全面描述 WRAP53 在食管鳞状细胞癌组织和癌周正常食管粘膜上皮组织的 表达特点，结合临床资料进行综合分析和统计学处理。 3. 应用细胞转染技术将特异性 siWRAP53 作用于食管鳞状细胞癌细胞株 EC109 细胞使 其 WRAP53 表达下调，MTT 法用于检测 WRAP53 表达下调对食管鳞状细胞癌细胞 株 EC109 增殖的影响，免疫印迹法检测 WRAP53 表达下调对凋亡蛋白 BAX 的影响， 流式细胞术检测食管鳞状细胞癌细胞株 EC109 凋亡率的变化，证实 WRAP53 表达 下调对食管鳞状细胞癌细胞株 EC109 细胞生长及凋亡的作用，应用细胞周期非特异 性抗癌药物顺铂处理 EC109，检测 WRAP53 在 RNA 及蛋白水平的变化情况。 结果: 1、食管鳞状细胞癌细胞系(EC109，EC9706，KYSE150和KYSE180)均能检测到WRAP53 蛋白和mRNA的表达，但WRAP53 蛋白和mRNA的相对表达量有明显的不同，原始 II万方数据 II 万方数据 肿瘤外侵较深的KYSE150和KYSE180（T4）WRAP53 的表达明显高于原始肿瘤外侵 较浅的EC109和EC9706（T3）；WRAP53蛋白和mRNA在食管鳞状细胞癌肿瘤组织中 的表达较癌周正常粘膜上皮组织中的表达明显升高(P＜0.001)。 2、免疫组织化学检测显示食管鳞状细胞癌组织WRAP53蛋白的阳性表达率明显高于癌 周正常粘膜上皮组织 (P0.001)；食管鳞状细胞癌组织及癌周正常粘膜上皮组织中 WRAP53主要定位于细胞核上,显示黄色或者棕黄色染色，食管鳞状细胞癌组织阳性表 达明显高于癌周正常组织（包括癌周粘膜上皮组织、间质组织、神经组织、平滑肌 组织等）；低分化的食管鳞状细胞癌组织表现为强阳性表达，可见核分裂象上染色； 高分化的食管鳞状细胞癌组织中，癌巢中间的角化珠特别是充分角化的肿瘤细胞呈 阴性表达；癌巢周边幼稚的肿瘤细胞呈阳性表达，癌巢中央成熟的肿瘤细胞则表达 逐渐降低。癌周食管正常粘膜上皮组织阴性或弱阳性表达，突出显示为基底细胞和 基底细胞层上方细胞核染色,上皮内乳头状增生组织细胞阳性表达，鳞状上皮中层和 表层呈阴性表达；WRAP53蛋白表达与食管鳞状细胞癌原发肿瘤浸润程度,TNM临床分 期显著正相关(P=0.001、P=0.007)，与区域淋巴结转移正相关(P = 0.026)，与年龄、 性别、病理分化程度无明显相关性（P＞0.05）。 3、WRAP53表达下调能抑制食管鳞状细胞癌细胞株EC109细胞的增殖，同时WRAP53 表达下调能增加EC109细胞BAX蛋白的表达和EC109细胞的凋亡率，细胞周期非特异 性抗癌药物顺铂能在RNA和蛋白水平降低WRAP53的表达。 结论: 1. 系统地证明了食管肿瘤组织及相应正常组织中 WRAP53 蛋白和 WRAP53mRNA 的表达差 异，WRAP53 蛋白和 WRAP53mRNA 在食管鳞状细胞癌组织中的表达较癌周正常