‘国光’苹果红色芽变果实着色分子机理初步研究-果树学专业论文.docxVIP

山东农业大学硕士学位论文 山东农业大学硕士学位论文 ‘国光’苹果红色芽变果实着色分子机理初步研究 ‘国光’苹果红色芽变果实着色分子机理初步研究 PAGE PAGE 1 PAGE PAGE 2 中文摘要 苹果（Malus domestica Borkh） 是世界上最主要的鲜食果品之一，其果实色泽是重 要的外观品质，直接决定其商品价值。 ‘国光’是 20 世纪 80 年代中国北方广泛种植的苹 果品种之一，具有晚熟、酸甜适口及抗逆性强等特点，近年来再次受到消费者的青睐， 但着色差一直是限制其发展的重要因素。2005 年课题组在山东省五莲县发现了一株‘国 光’的红色突变，其突出的特点是比国光着色早，着色好，成熟时果面片红。果皮的红 色主要由花青苷类物质的含量和成分决定的，花青苷是由一系列的酶促反应生成的次生 代谢物。前人以‘国光’为对照，从生理层面上对红色芽变花青苷积累及合成途径关键酶 的活性进行了研究。本文在此基础上，比较了两试材中花青苷合成相关结构基因、调节 基因的表达水平以及三个调节基因的编码区，找出了引发红色突变的关键基因；并通过 对关键基因 MdMYB1 基因组和上、下游调控序列的扩增和比对，以及 MdMYB1 启动子 区域的甲基化状态的比较，阐明了 MdMYB1 表达量差异的原因。主要研究结果如下： 1. 果实发育后期正常光照条件下的果实 MdCHS、MdF3H、和 MdUFGT 表达量逐 渐上升，采收前达到最大值；MdCHI、MdDFR1 及 MdLDOX 的表达量亦逐渐上升，但 在采收前略有下降；套袋处理（盛花后 30 天套袋，采收前 30 天除袋）的果实除袋前花 青苷合成结构基因表达量均很低，除袋后迅速上升；与正常光照条件下的果实相比，套 袋处理明显提高了 MdDFR1, MdLDOX 及 MdUFGT 的表达水平，但两不同光照处理 MdCHS, MdCHI 和 MdF3H 的表达差异不大。两种试材相对比，不同光照处理下红色 芽变 6 个结构基因表达水平均不同程度地高于‘国光’，且位于合成途径下游的结构基因 表达量差异更加明显。类黄酮合成另两条分支途径中，黄酮醇合成酶基因 MdFLS 的表 达水平明显低于‘国光’，而单宁生物合成途径中无色花色素还原酶基因 MdLAR1 和 MdANR 的表达量在两种试材中差异不明显，仅个别阶段芽变表达量略低。 2. 根据 MdMYB1, MdbHLH3 及 MdbHLH33 的 cDNA 序列设计特异引物，分别从 ‘国光’及其红色芽变中克隆出以上三个花青苷合成调节基因的编码区并进行测序比对。 结果表明两种试材中 MdMYB1 和 MdbHLH3 两种调节基因的编码序列完全一致，编码 结构相同的蛋白质；MdbHLH33 蛋白的结构略有差异：氨基酸序列中第 304 位的氨基酸 不同，‘国光’为甲硫氨酸（Met），而芽变中为苏氨酸（Thr）。 3．正常光照条件下，MdMYB1 的表达量随着果实成熟逐渐升高，后期达到最大值 并略微呈现下降趋势；套袋处理果实除袋前 MdMYB1 表达量很低，除袋后迅速上升。 与正常光照条件下的果实相比，套袋处理明显提高了 MdMYB1 的表达水平。两种试材 相对比，不同光照处理下芽变 MdMYB1 的表达量均明显高于‘国光’。MdbHLH3 的表达 与花青苷积累相关性不明显，MdbHLH33 的表达与 MdMYB1 显著相关；两试材 MdbHLH3 和 MdbHLH33 的表达量无明显差异。 4. 对‘国光’及其芽变 MdMYB1 基因组及上、下游序列进行克隆比对，琼脂糖凝胶电 泳检测显示对应序列的长度无差异，说明芽变 MdMYB1 内含子及上、下游调节序列中 无基因片段如反转录转座子等插入或缺失；对基因片段进行测序比对，也未发现两种试 材中有明显差异，说明芽变 MdMYB1 未发生 DNA 水平上的变化。对两种试材 MdMYB1 启动子区甲基化水平进行比较，发现红色芽变-965~-416 区域甲基化水平明显低于‘国 光’。 综上所述，红色芽变中花青苷合成结构基因表达水平协同上调；MdMYB1 表达量的 升高是引起结构基因上调的关键原因；MdMYB1 启动子区甲基化水平的降低是其表达上 升的根本原因。 关键词： ‘国光’，芽变，花青苷，MYB，DNA甲基化. Abstract Apple (Malus×domestica Borkh) is one of several main types of fresh fruits in the world. Skin color is an important component of fruit quality and significantly influences the market value