目的基因获得915ppt课件.ppt

第二章 基因工程的基本条件 一、用于核酸操作的工具酶 二、基因克隆载体 三、目的基因的获得 四、基因工程受体菌或细胞 三、目的基因的获得 限制酶酶切直接分离法 PCR扩增法 从mRNA合成cDNA 化学合成法 通过构建基因文库分离法 对已克隆在载体中的目的基因，可根据目的基因两侧的限制酶识别序列，选择适当的限制酶酶切，获得目的基因。 （一）限制酶酶切直接分离法 注意： 目的基因内部不能有该限制酶的切点，否则目的基因会被切成碎片！ （二）PCR法扩增目的基因 利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-退火-延伸的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的操作技术。 PCR(polymerase chain reaction)： 以目的基因为模板，合成互补的新DNA链。 双链DNA解链为单链DNA； 引物与模板单链DNA的特定互补部位配对、结合； 退火： 变性： 延伸： 变性 退火 延伸 30th cycle？ 由于每一循环所产生的DNA片段均能成为下一次循环的模板，故PCR产物以指数方式增加，即Y=2n (n为循环次数)。 230(109)copies PCR技术的发明--DNA操作技术的革命 1983.03 开汽车时的联想： 蜿蜒崎岖的山路--DNA双螺旋 行驶的汽车--一小段DNA引物 1972 在加州大学伯克利分校获得博士学位 1979 进入私人生物技术公司Cetus 1983.08 正式做有关PCR原理的报告 1983.09 Mullis开始动手做实验 1984.11 首次取得可信结果 1985.01 Randall Saiki加入，结果毋庸置疑 1985.03 Cetus公司申请专利 1985.12 Saiki RK, Scharf SJ, Faloona FA, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 1985,230(4732):1350-4. 1986.05 冷泉港“人类分子生物学”专题研讨会 1987.01 Mullis KB, Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology. 1987,155:335-50. 1991.12 Cetus以$3亿将专利卖给Hoffmann-La Roche公司 1986.06 Saiki等将耐热DNA聚合酶--Taq酶引入PCR技术。 Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 1988,239(4839):487-91. 1988.01 1989 Science杂志将PCR列为十余项重大科学发明之首， 比喻1989年为PCR爆炸年。 1986.09 Mullis离开Cetus公司 Eppendorf Bio-rad ABI PCR法扩增目的基因的前提： 已知目的基因全序列或其两侧序列，化学合成与模板互补的上、下游引物。 Taq酶无3’→5’外切酶活性，无阅读校正功能，在扩增过程中会引起错配，30次循环Taq酶错配率约0.25％。 措施： 问题： 可能造成目的基因碱基序列的改变。 原因： 选择高保真Taq酶，如Pfu。 因Taq酶对dATP具有优先聚合活性。 5’ A A PCR扩增产物 5’ 由Taq酶扩增的PCR产物，3’末端总是带有一个非模板依赖型的突出碱基，而这个碱基几乎总是A，