猪伪狂犬病病毒地方分离株的生物学特性的研究.docVIP

PAGE PAGE 6[收稿日期] 2009-08-20[作者简介] 沈强（1966- ），男，南京农业大学硕士，现任上海市奉贤区动物疫病预防控制中心主任，高级兽医师，长期从事兽医生物技术的研究和应用。猪伪狂犬病病毒（PRV）地方分离株的生物学特性研究沈 强 卫秀余 刘婧怡 瞿 慧（上海市奉贤区动物疫病预防控制中心，上海奉贤：201400）摘 要：从上海奉贤某猪场采集发病死亡的仔猪大脑、扁桃体等病料组织接种细胞，分离到猪伪狂犬病病毒PRV，经克隆纯化后测得其毒价为107.71TCID50/ml。分离毒株PRV对氯仿、乙醚敏感，并能被猪伪狂犬病闽A株阳性血清中和。家兔、哺乳仔猪接种PRV后发病死亡。经电镜负染观察到病毒的囊膜及外周纤突。综合本病毒的各种特性，鉴定为猪伪狂犬病病毒。关键词：伪狂犬病病毒；克隆纯化；电镜猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒（PRV）引起的一种急性传染病，其中主要特征为成年猪呈隐形感染，妊娠母猪发生流产、死胎及呼吸道症状。仔猪感染后常发热并表现明显的神经症状，不久肢体麻痹、衰竭死亡。本病在猪群中还具有传播快，仔猪死亡率高的特点。目前已在大部分地区流行，给养猪业造成巨大的经济损失。我们从上海奉贤某一发生10—20日龄哺乳仔猪发病死亡、并伴有神经症状的猪场采集了病料，进行了病毒的分离鉴定工作，并对分离病毒的部分生物学特性进行了初步研究。1 材料与方法1.1 材料1.1.1病料：上海奉贤某发病猪场的病死仔猪（12日龄），无菌采取其大脑组织、扁桃体、肺、肝、肾等作为病毒分离材料。1.1.2 PRV湖北株病毒：华中农业大学动物医学院惠赠1.1.3 BHK21传代细胞：南京农业大学动物医学院惠赠。1.1.4 Vero传代细胞：南京农业大学动物医学院惠赠。1.1.5 鸡胚成纤维细胞（CEF）：用10日龄SPF鸡胚自制。1.1.6 犊牛血清：上海实生细胞生物技术公司，批号1.1.7 MEM培养基：美国Life Technologies公司产品，批号1.1.8 胰酶：美国Difico公司，上海化学试剂供应站分装，批号1.1.9 猪伪狂犬病病毒闽A株阳性血清：华南农业大学动物医学院惠赠。1.1.10 PRV-gB抗体检测试剂盒：美国IDEXX公司产品，1.1.11 健康大耳白兔：体重1.5～21.1.12 1.1.13 24孔细胞板：浙江黄岩拱东化学塑料实验厂产品。1.1.14 倒置显微镜：日本Olympus公司制造1.2 病毒的分离1.无菌采取的病死仔猪的大脑、扁桃体等组织，置于研钵研磨至糊状，加入含有双抗的Hank′s液制成1：10乳剂，经反复冻融三次后，3000转/分钟离心30分钟，弃沉淀取上清备用。1.将上清分别接种于单层Vero、BHK21和CEF细胞，37℃孵育1小时后加维持液继续培养，并设PRV湖北株接毒细胞和正常细胞对照，16小时1.3 分离毒株的克隆纯化将分离毒株用维持液作10倍系列稀释，取10－3、10－4、10－5、10－6、10－7、10－86个稀释度接种24孔细胞板，每个稀释度接种4孔，每孔100ul。经37℃培育箱孵育1小时后，加入44℃营养琼脂，每孔1ml，待凝固后翻转细胞板，置于含5％CO2的二氧化碳培养箱内培养，每个24小时观察一次。4天后在产生可数空斑的稀释度上数空斑个数，计算空斑形成单位（PFU），并观察空斑大小、形态，选择小而孤立的空斑挑出，加入含0.5ml营养液的eppendorf管中，经冻融三次后3000转/分钟离心101.4分离病毒的TCID50滴定取分离病毒（PRV）克隆株细胞毒液，用10倍系列稀释再分别接种于BHK21细胞（96孔细胞板）上，每个稀释度接种8孔，每孔100ul，37℃感染1小时后加维持液继续培养，4天后观察细胞病变，判定结果，按Reed与muench氏法计算病毒的TCID501.5 分离病毒的理化特性实验1.取病毒上清液20份加氯仿（分析纯）1份，摇振混匀，在4℃放置10分钟后，3000转/分钟离心10分钟，取上清液作10倍系列稀释，滴定TCID501.取病毒悬液4份加乙醚（分析纯）1份，摇振10分钟后，放置4℃冰箱内作用24小时。再将病毒乙醚混合物3000转/分钟离心10分钟，取下层溶液作10倍系列稀释后滴定病毒的TCID501.取病毒悬液2ml于试管中，50℃水浴30分钟后，作10倍系列稀释滴定TCID50，对照用病毒悬液于4℃放置30分钟后也作10倍系列稀释后滴定TCID1.取病毒液1ml，加1.0mol/L MgCl2溶液9ml，充分混匀后，放置于50℃水浴中1小时，取出后作10倍系列稀释，滴定病毒TCID50，对照采用1ml病毒液加9ml维持液，同样放置于50℃水浴1小时