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RNAi抑制内源性基因表达在肝脏疾病研究中的应用 作者：赵中夫　张国英　杨慧　刘明社　韩德五 【关键词】 RNA干扰技术 　　关键词 RNA干扰技术;内源基因;TNF-α;Fas;caspase-8 　　RNA干扰（RNA interference，RNAi），即用核苷酸组成的短的双链RNA（dsRNA）代替传统反义核酸进行转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing PTGS）。自2001年、2002年连续两年被美国《Science》杂志评选为年度10大突破技术之一以来，2003年～2004年继续热度高涨，已经迅速而广泛地应用到基因功能、基因表达调控机制研究等热门领域，并为基因治疗开辟了新的途径。RNA干扰技术，以其高度的特异性和有效性，在功能基因组学研究中，被认为是非常有用的工具。在医学研究中，它不仅能有效抑制外源性基因的表达，显示较好的抗病毒应用价值，而且，能非常特异地沉默内源性基因的表达，为我们通过选择性地抑制有害基因表达，研究抗炎症、抗凋亡、抗肿瘤等治疗策略提供了新思路和方法 ［1］ 。 　　1 RNA干扰机制及技术原理 　　当病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21bp～23bp），即siRNA。 　　siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。RISC与外源性基因或内源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，因RISC具有核酸酶的功能，在结合部位可以切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。另外，siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsR-NA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解 ［2］ 。 　　RNAi干扰现象具有以下几个重要的特征:①RNAi是转录后水平的基因沉默机制;②RNAi具有很高的特异性，只降解与之序列相应的mR-NA ［3，4］ ;③RNAi抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子（数量远远少于内源mRNA的数量）就能完全抑制相应基因的表达;④dsRNA不得短于21个碱基，并且长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21bp左右的siRNA，并由siRNA来介导mRNA切割。大于30bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰，而使细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡;⑤ATP依赖性:在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程 ［5］ 。 RNA干扰技术的关键是要根据内源或外源靶序列来设计合成由21nt～23nt组成的siRNA或者siRNA表达载体，并以某种方式将其导入靶细胞中，从而诱发靶序列的特异性降解，阻止靶序列继续表达和翻译。 人体的许多疾病是由外源基因入侵或内源基因突变和异常表达所引起的。针对以病毒感染为主的外源基因入侵的RNAi研究已经广泛开展并取得了一定成果。如抗HIV ［6～8］ 、抗HCV ［9，10］ 、抗脊髓灰质炎病毒 ［11］ 和鼠疱疹病毒 ［12］ 、抗HBV ［13］ 等，而针对由于内源基因突变或异常表达所引发的疾病，RNAi同样发挥重要作用。现就RNAi抑制某些内源性基因过度表达或肿瘤基因表达在肝脏疾病中的应用研究进展情况报告如下。 　　2 RNAi对内源性基因的抑制作用 　　2.1 RNAi抑制体内TNF-α过度表达　TNF-α是一具有多种生物学活性的多肽调节因子，来源于单核巨噬细胞。适量的TNF-α可以调节机体免疫功能，对维持机体内部的稳定状态及抵御各种致病因子具有重要意义。然而，TNF-α的异常分泌又可作为机体炎症、损伤及休克的重要介质 ［14］ 。 近年来，肠源性内毒素血症（intestinal endotox-emia，IETM）与肝病的关系日益受到重视，急、慢性肝炎、重型肝炎、肝硬化与肝癌患者的IETM发生率报道不一，其中以重型肝炎患者IETM的发生率（80%～1