外科学(神经外科)专业毕业论文 [精品论文] 基于超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒的恶性胶质瘤靶向联合基因治疗.docVIP

外科学(神经外科)专业毕业论文 [精品论文] 基于超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒的恶性胶质瘤靶向联合基因治疗 关键词：恶性胶质瘤 胞嘧啶脱氨酶 四氧化三铁 磁性纳米颗粒 靶向联合基因治疗 基因转运体系 摘要：第一章 目的：制备能够应用于胶质瘤靶向联合基因治疗的四氧化三铁磁性纳米颗粒，建立以超顺磁性Fe3O4磁性纳米颗粒为基因载体的胶质瘤基因治疗基因转运体系，并评价该体系的体外基因转运效率。 方法：以2-吡咯烷酮和乙酰丙酮铁为原料，采用高温分解铁有机物法是将铁前驱体高温分解得到铁原子，再由铁原子生成铁纳米颗粒，将铁纳米颗粒控制氧化得到四氧化三铁纳米颗粒；再以偶联剂γ-氨丙基三乙氧基硅烷(NH2C3H6Si(OC2H5)3)对Fe3O4磁性纳米颗粒(Fe3O4 magnetic nanoparticle，Fe3O4 MNP)表面修饰；将CD基因转染U251胶质瘤细胞，得到U251-CD细胞，免疫荧光染色检测本体系的转染效率。通过Fe3O4MNP与质粒pCMVCD结合试验，Fe3O4MNP-pCMVCD复合物的DNase-I消化，血清消化保护实验结果检测Fe3O4 MNP结合DNA的能力及对DNA的保护效果。采用RT-PCR、Westem blotting，和高效液相色谱法等检测CD基因的mRNA水平和CD蛋白水平，U251-CD细胞。MTT法测定检测U251-CD细胞的5-FC化疗效果及旁观者效应。 结果：制备出稳定性好、单分散、粒径小、粒径分布范围窄(10±2nm)的磁性Fe3O4/氨基硅烷复合纳米颗粒，以γ-氨丙基三乙氧基硅烷作分散稳定剂，改善了磁性Fe3O4纳米颗粒表面的疏水环境，有效地阻止了四氧化三铁纳米颗粒团聚的发生。当Fe3O4MNP与质粒pCMVCD质量比为0.05：1时，结合的质粒量amp;lt;20％；当二者质量比为1：1时，几乎可以结合体系中的全部质粒。Fe3O4MNP-pCMVCD复合物能够保护质粒pCMVCD免受Dnase-I及血清的消化作用，保持其结构稳定。使用Fe3O4ⅣrNP作为载体成功将CD基因成功转染U251细胞，转染细胞有CD基因稳定表达，呈时间相关性增强表达模式(转染后5天内呈现表达持续增加模式)，转染效果明显优于脂质体转染对照组。Fe3O4 MNP的转染效果与Fe3O4 MNP的用量呈正相关，且无明显的细胞毒性，经MTT检测Fe3O4 MNP在50mg/L以下时不影响U251细胞的生长曲线。U251-CD细胞加入5-氟胞嘧啶(5-FC)后，细胞培养液上清中，经高效液相色谱检测出U251-CD细胞生???的高浓度5-氟尿嘧啶。能显著的抑制U251细胞生长。U251与U251-CD混合细胞中，在加入5-FC(终浓度1000uml/L)后，10％的U251-CD细胞可以杀灭20~30％的U251与U251-CD混合细胞与对照组(O％组)相比Pamp;lt;0.01，15％的U251-CD细胞可以杀灭约50％U251与U251-CD的混合细胞；30％的U251-CD细胞可以杀灭约80％U251与U251-CD的混合细胞：50％以上的U251-CD细胞可以完全的杀灭U251与U251-CD的混合细胞。 结论：制备的经γ-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒粒径小，生物相容性提高，达到作为基因载体应用于胶质瘤靶向联合基因治疗要求。超顺磁性Fe3O4纳米颗粒基因转运体系在体外U251胶质瘤细胞系应用中转染效果显著。Fe3O4MNP/CD/5-FC胶质瘤基因治疗系统应用于胶瘤基因治疗体外试验抑瘤效果突出，可应用于下一步动物体内实验检测。 第二章 目的:在第一章的Fe3O4MNP/CD/5-FC胶质瘤基因治疗系统成功研发的基础上，为优化该基因治疗系统，研发wt-p53、wt-p16基因联合胞嘧啶脱氨酶( Cytosine Deaminase，CD)/5-FC系统治疗神经胶质瘤的可行性，以期能提高胶质瘤化疗效果及逆转胶质瘤干细胞对化疗药物产生多药耐药性。 方法:分离培养并鉴定U251细胞系及30例临床胶质瘤病理标本(WHOⅢ级、IV级)的胶质胶干细胞。利用Fe3O4MNP为基因载体分别将质粒pCDNA3.1-p16、pYD5-p53，及pCMVCD转染至U251细胞、各组病理组织分离的胶质瘤细胞及其胶质瘤干细胞(Glioma stemcells，GSC)。采用RT-PCR、Western blotting检测目标基因转染后在相应的细胞中的表达情况。MTT法检测不同基因治疗方案的U251细胞及U251GSC细胞的对CD/5-FC的治疗敏感性；并检测四种临床常用化疗药物VM-26，VP-16，TMZ，5-FU对不同基因治疗方案的U251及U251GSC的生长抑制率。使用An