酶工程第8章兰州大学酶工程固定化酶与固定化细胞.pptVIP

第八章 固定化酶与固定化细胞 一、酶的固定化方法概述 游离酶和游离细胞催化反应的缺点 固定化酶和固定化细胞催化反应的优点 固定化细胞和发酵的比较 固定化酶的研究历史 固定化酶在工业上的应用 固定化酶的制备方法分类 1．载体结合法 物理吸附法的优缺点 载体结合法 离子结合法的优缺点 载体结合法 用于共价结合的载体 共价结合的优缺点 2．交联法 3．包埋法 包埋法的优缺点 包埋法 包埋法 微囊型固定化酶的特点 二、固定化技术 不同物理吸附法的适应性 影响酶吸附的因素 影响酶吸附量的主要因素 （2）离子结合 （3）共价结合 ① 重氮化 ② 形成酰胺键 ② 形成酰胺键 ② 形成酰胺键 ② 形成酰胺键 ② 形成酰胺键 ② 形成酰胺键 ③ 烷基化和芳基化 ③ 烷基化和芳基化 ③ 烷基化和芳基化 ③ 烷基化和芳基化 ③ 烷基化和芳基化 ③ 烷基化和芳基化 ④ 脒基化反应 ⑤ 无机载体表面硅烷化 （4）金属键合／螯合 钛金属键合/螯合 用TiCl4活化无机载体并与酶结合 用TiCl4活化无机载体并与酶结合 2．交联固定法 戊二醛与酶形成希夫碱连接 戊二醛交联的原理 戊二醛交联的原理 影响戊二醛交联的因素 3．包埋固定法 （1）网格包埋法 海藻酸钙凝胶包埋法 海藻酸钙凝胶包埋的优缺点 （1）网格包埋法 κ-角叉菜胶包埋法 （1）网格包埋法 （1）网格包埋法 明胶包埋加交联 （1）网格包埋法 光交联树脂孔径的调节 （2）微囊包埋法 界面沉淀法所用的各种成分 用异丁烯橡胶微囊包埋过氧化氢酶的方法 用异丁烯橡胶微囊包埋过氧化氢酶的方法 （2）微囊包埋法 界面聚合法的特点 （2）微囊包埋法 脂质体包埋法 4．辅酶的固定 辅酶的固定 辅酶的固定 主反应和再生反应的共组合形式 主反应和再生反应的独立进行形式 ATP 的再生反应 NAD(P) ＋的再生反应 固定化细胞 ① 界面沉淀法 这是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成膜将酶包埋的方法。一般是先将含保护剂的酶液在与水不互溶的有机相中乳化，在油溶性的表面活性剂存在下形成油包水的微滴，微滴的大小由搅拌的速度和时间决定。再将溶于有机溶剂的高聚物加入乳化液中，然后加入一种不溶解高聚物的有机溶剂，使高聚物在油水界面上沉淀、析出、形成膜，将酶包埋。 酶保护剂常用的有牛血清白蛋白（BSA）、血红蛋白、聚乙烯亚胺（PEI）等；有机相一般是醚、环己烷、甲苯等；高聚物是硝酸纤维素、乙酸纤维素、异丁烯橡胶等；表面活性剂可以用Span 85。 此法条件温和，酶失活少，但要完全除去膜上残留的有机溶剂很麻烦。 A．准备下列四种混合物： a．2.6g乳化剂Span 85，25ml环己烷； b．1ml 50mmol/L的磷酸缓冲液，pH7.0，含 过氧化氢酶650单位； c．0.1g异丁烯橡胶，50ml环己烷，搅拌1～2 小时使其完全溶解； d．15ml环己烷，10ml菜油。 B．把混合液a加入到混合液b中，不断搅拌； C．再加入混合液c，不断搅拌； D．边搅拌边加入混合液d ； E．抽真空至26mmHg柱，在连续搅拌下环己烷 蒸发，蒸发不能太快； F．离心含有微囊的油相，倾去上部油层，加入 15ml磷酸缓冲液，再悬浮颗粒，离心除去 上清液；重复若干次； G．悬浮微囊于含有吐温20的缓冲液中。 ② 界面聚合法 这是将亲水性单体和疏水性单体利用界面聚合的原理包埋酶的方法。例如，将含10％血红蛋白的酶液与1,6-己二胺的水溶液混合，立即在含1％Span 85的氯仿-环己烷中分散乳化，加入溶于有机相的癸二酰氯后，在油水界面上发生聚合反应，形成尼龙膜，将酶包埋。 除尼龙膜外，还有聚酰胺、聚脲等形成的微囊。此法制备的微囊大小能随乳化剂的浓度以及乳化时的搅拌速度而自由控制。制备过程所需时间非常短，但在包埋时由于发生化学反应而容易引起酶失活。 ③ 脂质体包埋 脂质体是由磷脂类或其它脂类所组成的一种微粒。磷脂在水中搅拌以后能自动排列成双分子层，或者多层次的双分子层，形成内部含水的球形颗粒。含酶的脂质体常用于治疗缺酶病。 制备脂质体的方法很简单。取40μmol卵磷脂、11.4μmol胆固醇、5.7μmol二乙酰磷酸，用氯仿或其它有机溶剂配成2～3ml溶液，加到一干燥的50ml圆底烧瓶中，在旋转蒸发器内37℃蒸去溶剂，溶质在瓶底形成一薄层。取下烧瓶立即加入1～2ml酶液及几粒玻璃小球，轻轻摇晃，即得乳状脂质体的悬浮液，离心除去溶液，用缓冲液洗脂质体几次，最后将脂质体放在1％氯化钠溶液中保存。 有些酶需要辅酶才能催化反应，如一些脱氢