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凝胶层析法分离纯化蛋白质 【目的】 掌握凝胶层析的基本原理 学习利用凝胶层析法分离纯化蛋白质的实验技能 一、基本原理： 凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离的技术。 相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，移动速度快；所以首先流出。 相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，移动速率慢；所以最后流出。 中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。 凝胶层析法纯化低密度脂蛋白(LDL) 二. 凝胶层析的介质 葡聚糖凝胶 （Sephadex） 琼脂糖凝胶（Sepharose ） 聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P） Superdex凝胶 其他凝胶：多孔硅胶 、多孔玻璃珠 1. 葡聚糖凝胶 （Sephadex） 商品名为Sephadex 交联葡聚糖的基本骨架是葡聚糖。再经1-氯-2，3-环氧丙烷为交联剂，形成三维网状结构的高分子化合物。 其交联度是通过交联剂的加量及反应条件来控制的。 葡聚糖凝胶命名 根据凝胶孔径由小到大分别命名为 Sephadex G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、 G-100、G-150和G-200 G后面的数字是1g干胶吸水mL数的10倍 G后面的数字越大，凝胶的孔径越大，适于分离的蛋白质分子质量越大 葡聚糖凝胶（G类）的规格 葡聚糖凝胶特点 具有较好的化学稳定性 能耐受一定的酸碱，pH 2～10 洗脱流速一般在2-5ml/min 2 琼脂糖凝胶（Sepharose ） 结构是由β-D-半乳糖与3，6-脱水-L-半乳糖以α-1， 3-和β-1，4-糖苷键相间连接而成的链状分子。 琼脂糖凝胶商品名 GE healthcare Sepharose-2B、4B、6B(琼脂糖的百分含量分别为2％、 4％、6％)，分离分子质量范围从100KD ～ 10 000KD。 琼脂糖凝胶特点 在pH4-9稳定 对样品的吸附作用小 机械强度和稳定性好 琼脂糖凝胶分辨率较低 不耐高温，在40℃以上开始融化，使用温度以0～30℃为宜。 3. 聚丙烯酰胺凝胶 商品名为 Bio-Gel P 由丙烯酰胺(Acr)与甲叉双丙烯酰胺(Bis)交联而成 调节Acr和Bis的浓度，就可以得到孔径大小不同的交联物。 聚丙烯酰胺凝胶的性质 主要型号有Bio-Gel P-2、P-4、P-6、P-l0、P-30、P-60、P-100、P-150、P-200、P-300。 P后面数字的103倍代表凝胶的排阻极限。 聚丙烯酰胺凝胶的特点 分辨率较高, 在pH l～10的水溶液中较为稳定，不耐碱和高温 吸附作用较大 4. Superdex凝胶 由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而成。 物理化学稳定性好，分辨率高。 机械强度高，耐压，洗脱流速快。 5. 其他凝胶 多孔硅胶 由硅胶制成的网孔状球形颗粒。 机械强度高、化学稳定性好、使用寿命长。 多孔玻璃珠 由玻璃所制成的网孔状球形颗粒。 机械强度高、化学稳定性好 6. 凝胶预处理 Sepharose (GE healthcare) 保存20%的乙醇, 使用前去除乙醇 Sephadex Gs (GE healthcare), 干胶, 使用前须充分泡涨，使干胶颗粒充分吸收溶剂， 并达到平衡。 请问: 选择哪一种凝胶作为纯化LDL的介质? 三. 凝胶层析常用术语 1. 保留值（Retention Value）是表示样品中各组分在层析柱中停留时间的长短。或组分流出时所需流动相体积的多少。它用来描述层析峰在层析图上的位置。 2.层析峰区域宽度 标准差：因分离过程中流出的曲线是正态分布曲线，两侧拐点之间的距离为2个标准差σ。σ的计算是流出峰到基线的距离为峰高的0.607倍，所以σ为峰高0.607倍处层析峰宽度的一半，见图5。σ大，说明组分流出分散，层析峰宽度也大，是柱效不高的表现。反之，σ小，表示组分在层析柱中集中，层析峰就窄，柱效也高。 半峰宽（W1/2） W1/2=2.354σ 峰宽（Wb） 是指通过层析峰两拐点作切线交于基线上的截距。Wb=4σ。 3. 分离度（Rs） 分离度是指相邻两峰的保留差值是两峰宽平均值的几倍。分离度愈大，说明分离效果愈好。 一般用垂直线法来计算: 连接两