复旦大学研究生课程PPT DNA复制4.pptVIP

端粒和端粒酶发现大事记 1939年，Barbara McClintock发现玉米细胞的染色体断裂末端容易融合1972年，James Watson提出染色体复制的末端隐缩问题1978年，报道四膜虫的端粒序列1982年，端粒的发现导致人工染色体的发明1984年，报道酵母的端粒序列1985年，报道四膜虫的端粒酶活性1989年，报道四膜虫端粒酶的RNA亚基1994年，报道酵母端粒酶的RNA亚基1995年，报道酵母端粒酶活性1996年，纯化了四膜虫端粒酶的催化亚基,遗传筛选到酵母端粒酶的催化亚基1997年，证明了四膜虫和酵母端粒酶的催化亚基 端粒酶以自身的RNA为模板， 在3端合成DNA序列: 逆向转录(Reverse Transcription) 上世纪之初发现肿瘤RNA病毒。 64年，Temin报道了抑制DNA合成的放线菌素D能抑制鸡肉瘤RNA病毒的繁殖。 据此提出鸡肉瘤RNA病毒的繁殖须经过形成DNA的阶段。 70年Temin 和Baltimore 两个实验室同时从(鸡)劳氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病RNA病毒中发现，在逆转录病毒病毒颗粒中存在着一种以RNA为模板合成DNA的酶，称为RNA指导的DNA聚合酶。 遗传信息从RNA流向DNA，即以RNA为模板合成DNA称为逆向转录，因此催化这一反应的酶又称逆转录酶。 逆向转录酶 由逆转录病毒基因组中pol基因编码。是一种多功能酶。 有以RNA为模板和以DNA为模板合成DNA的DNA聚合酶活性。 需要RNA或DNA做引物； 有核糖核酸酶H的活性（在逆转录酶的C端），能从3’→5’和从5’→3’水解RNA，使RNA与DNA的杂交体分离。 逆向转录过程 三 逆向转录酶的生物学意义 1 用于合成cDNA. 建立cDNA文库(cDNA Library)，获得基因或探针。 2 与PCR连用 RT-PCR 第四节 DNA复制的调控 DNA复制是细胞增殖的一个关键事件，因此，DNA复制与细胞分裂是互相协调、互相调控的。 无论原核还是真核细胞中DNA复制都只发生在细胞周期中特定时期，在一个细胞周期中，DNA必须也只能复制一次。 一 大肠杆菌复制的调节 1、起始体 （ orisome，起始复合物，蛋白质-ori C复合物）的装配 参与形成orisome的组分： Dna A, Hu, IHF，Fis，Dpi， Ici A， Cnu，Hha，Rob，Seq A，Arc A 相互作用 ：Fis, IHF 调节 DnaA-ATP与oriC 的结合，HU调节DnaA, IHF 结合到oriC, 并增强DnaA解链能力。 2、防止复制再次起始 (1) Dna A活性的抑制 Dna A-ADP Dna A-ATP 无活性 RIDA 有活性 (3)隔离 ori C 二 真核生物复制起始调控 1、DNA复制起始的调控 2、细胞周期监控点机制 (一)、DNA复制起始的调节 1、复制起始点的选择 复制起始点数量的调控 真核细胞有多个复制起始点，起用多少起始点决定于S期的长短。 S期短，起始点多。S期长，起始点少。 遗传性起始点： DNA上的起始元件 功能性起始点： 实际起始点 遗传性起始点多于功能性起始点 酵母：自主复制序列（autonomously replicating sequeences, ARS) 酵母细胞3号染色体上有14个遗传性复制起始点，只有6个功能性复制起始点。 将Ura4基因处的强复制起始点突变后，在其附近的弱复制起始点就成为强复制起始点。 Ura4：乳清苷酸脱羧酶 高等真核生物细胞至今未发现遗传性复制起始点的序列特征，但确实存在功能性的复制起始点。 CHO细胞核 蟾蜍卵细胞抽提物 损坏CHO细胞核或 裸露DNA 非随机起始，同正常 随机起始 CHO细胞 复制起始点的选择与细胞核或染色体结构密切相关 2、 复制起始调控机制 （1）复制的允许机制（Licensing model） （2）蛋白激酶的调控 （1） 复制的允许机制（Licensing model）  一个细胞周期中DNA复制发生一次且只能发生一次 蟾蜍卵细胞