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低温纤维素降解复合菌系选育及性能分析 　　摘要：以腐木和堆肥样品为材料，通过限制性继代培养和混合培养，筛选出一组高效稳定的低温纤维素降解复合菌系Y。对复合菌系Y不同生长阶段pH、酶活、失重率及产物之间的相互关系进行了研究。结果表明，0～6 d为复合菌系Y的对数生长期，4 d内滤纸条完全崩解，在20 ℃下静置培养10 d，水稻秸秆的降解率达到59%，酶活为103.5 U/mL，主要代谢产物为乙酸，并有少量的丁酸和丙酸，含量分别为1.70、0.21、0.12 g/L，其中乙酸占总挥发酸含量的85%。复合菌系Y适用于以秸秆为原料的低温产沼气发酵。 　　关键词：低温纤维素降解复合菌系；选育；水稻秸秆；代谢产物 　　中图分类号：X172 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）08-1814-03 　　我国每年农作物秸秆产量高达7亿多吨，除很少一部分得到利用外，大部分被堆积或焚烧，不仅浪费资源，还对环境造成污染[1]。利用微生物发酵技术将纤维素转化为有机酸、醇、甲烷以及氢气等化工原料和能源[2]，对解决当今所面临的能源危机和环境污染问题具有重要的现实意义。 　　由于很多菌株不能产生全组分的纤维素酶，且所产酶的活性不高，常常依靠两种或多种微生物共同培养完成，因此，复合菌系的作用逐渐得到重视[3-6]。目前，国内外关于纤维素降解菌研究主要集中在单菌株的分离筛选、鉴定以及中高温复合菌系的选育[7-9]，对低温纤维素降解复合菌系的研究较少。因此，试验通过限制性继代培养，从3种不同样品中驯化筛选复合菌系，并就其对纤维素的降解能力以及在培养过程中pH、酶活及产物的动态变化进行研究与分析，以期选育出一组高效稳定的低温纤维素降解复合菌系。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　1.1.1 样品来源 黑龙江北部山区腐木、东北农业大学微生物实验室堆肥样品及沼渣，样品编号分别为YC、DF、ZZ。 　　1.1.2 培养基 液体筛选培养基[8]：蛋白胨5 g，酵母粉1 g，NaCl 5 g，CaCO3 2 g，粉碎水稻秸秆2 g，微量元素溶液0.5 mL，去离子水1 000 mL。 　　微量元素溶液成分（g/L）[9]：ZnSO4 0.29，CaCl2 0.24，CuSO4 0.25，MgSO4 0.17。 　　1.2 试验方法 　　将3种样品接入200 mL筛选培养基中，放入两片滤纸条作为指示，20 ℃恒温静置培养。待滤纸条降解完全时，转接于同样的新鲜培养液中，如此转接数代，筛选降解速度快且性能稳定的样品，并将其相互配合培养，直至筛选高效稳定的复合菌系。 　　1.3 测定指标及方法 　　1.3.1 纤维素失重率的测定 将培养结束后的培养液离心，去上清，然后用盐酸和硝酸的混合液冲洗剩余物，以除去残留的菌体和碳酸钙，再用清水反复冲洗多次，最后置于烘箱中烘至恒重[3]。计算失重率。 　　1.3.2 纤维素酶活性测定 培养液经5 000 r/min离心10 min，DNS法[10]测定上清液Cx酶、C1酶和β-葡萄糖苷酶的活性。定义40 ℃反应条件下，1 min内水解底物产生1 mmol还原糖（以葡萄糖计）所需的酶量为一个酶活单位[11]。 　　1.3.3 生长曲线的制作 用250 mL的葡萄糖瓶装入180 mL培养基，接入20 mL种子液，20 ℃静置培养，每隔24 h取样，用北京普析T6新世纪紫外可见光分光光度计测定600 nm处的吸光度，以未接菌的培养基作对照。 　　1.3.4 pH测定 采用上海伟业仪器厂pHS-3C型数字pH计进行测定。 　　1.3.5 培养液中有机酸含量测定 采用美国Agilent 6890N型气相色谱对接菌10 d的培养液进行测定[12]。 　　1.3.6 水稻秸秆纤维组织电镜观察 将复合菌系Y以5%接种于筛选培养液（水稻秸秆未经粉碎），同时以未接菌的培养液作为对照，培养7 d，在扫描电子显微镜（SEM）下观察水稻秸秆组织变化。 　　2 结果与分析 　　2.1 复合菌系的驯化筛选结果 　　采用1.2的驯化筛选方法，样品YC和DF培养物在20 ℃静置培养条件下都有较强纤维素分解能力，将这两种培养液混合，得到复合菌系Y，复合菌系Y在4 d内可使滤纸条完全崩解，将Y、YC、DF 3种样品继续传代驯化直到降解能力达到稳定。经过几代培养之后复合菌系Y的酶活一直保持较高水平并且十分稳定，第10天降解率可达到59%（图1），总酶活达到103.5 U/mL（图2）。 　　2.2 复合菌系Y生长曲线 　　从图3可以看出，复合菌系Y没有经过延滞期就进入对数生长阶段，原因可能是微生物经过多代驯化，复合菌系Y自身形成了相对的生态稳定性[13]，从而使其在极短的时间内就适应了培养环境。微生物