双重信号放大乙酰胆碱酯酶电化学传感器检测有机磷农药.doc

双重信号放大乙酰胆碱酯酶电化学传感器检测有机磷农药 　　1引言 　　有机磷农药（Organophosphate pesticide， OP）是目前使用量最大的农药种类之一，已被广泛应用于农业生产中植物病虫害的防治。不合理地使用OP，使其在植物体内大量残留。该类农药属于强的神经毒剂，能不可逆地抑制人体内乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase， AChE）的活性[1]，使其催化水解乙酰胆碱的能力受到抑制，导致乙酰胆碱在体内积累，从而使人体神经系统中一些生理功能受到影响，严重时甚至导致死亡[2，3]。因此，建立一种响应快速、灵敏度高、准确可靠的检测OP的新方法具有重要意义。 　　目前，气相色谱法[4-6]、高效液相色谱法[7-9]、气相色谱质谱法[10]等已广泛用于检测OP，而且能够得到准确的结果，但这些方法大多仪器贵重、操作复杂、耗费时间长，不便于现场检测。近年来，电化学传感检测方法因其操作简单、响应快速、灵敏度高、仪器便宜等优点更是备受关注。目前OP的电化学传感检测方法[11-14]一般利用其对AChE的不可逆抑制作用，通过检测AChE催化水解氯化乙酰硫代胆碱（Acetylthiocholine， ATCl）产生硫代胆碱氧化电流的大小，实现痕量有机磷农药的检测。有机磷农药对AChE的抑制率与硫代胆碱的氧化电流的减小量成正比，但是其氧化电位较高，其它干扰物质在这一电位下也会氧化，产生氧化电流，造成干扰。 　　本研究构建一种新型AChE电化学传感器，用于OP的检测。首先，金电极表面的AChE在没有纳米金种子的情况下催化底物ATCl产生硫代胆碱，硫代胆碱还原氯金酸，生成纳米金种子；将电极置于银增强液中，纳米金催化银在较低的电位下沉积形成银包金的核壳结构，而聚集的银又进一步催化更多Ag+还原，用溶出伏安法定量检测沉积银的量，实现了信号的再次放大。该传感器基于生物催化纳米金粒子的生成和纳米金粒子电催化银沉积，实现了信号的双重放大，而在没有纳米金颗粒的区域，银不会被催化还原[15-17]，使得背景电流很小，与其它电化学AChE传感器相比，具有更低的背景干扰和检出限[18，19]。 　　2实验部分 　　2.1仪器与试剂 　　CHI 900B电化学工作站（上海辰华仪器公司）；三电极系统：壳聚糖修饰的组装了乙酰胆碱酯酶的金电极（AChECHIT/Au）为工作电极，饱和Hg2Cl2电极（SCE）为参比电极，铂电极为辅助电极。用CHI 660C工作站，于5 mmol/L Fe（CN）64 　　氯化乙酰硫代胆碱、乙酰胆碱酯酶（Type C3389，500 U/mg）和戊二醛（25%），购自美国SigmaAldrich公司；马拉硫磷（标准品）、壳聚糖Chitosan（CHIT，脱乙酰度为85%）、氯金酸 （HAuCl4·4H2O）、AgNO3、磷酸盐缓冲液（PBS， pH=7.4）、铁氰化钾、亚铁氰化钾等。其它试剂均为分析纯，水溶液均用超纯水配制。1.0 mol/L NH32.0×10 　　Symbolm@@ 3 mol/L AgNO3的混合溶液作为银增强剂溶液（现用现配）。 　　2.2AChEChitosan 修饰电极的制备 　　用2.0 mol/L 乙酸溶液溶解壳聚糖，配制成质量分数为0.5%（w/V） 的壳聚糖溶液，用NaOH溶液调至pH=5.0，放于冰箱中备用。 　　金电极在修饰前，先分别用0.3和0.05 μm的氧化铝粉抛光至形成镜面，再将电极于超纯水、乙醇和超纯水中各超声5 min洗净，用N2吹干。在打磨处理好的金电极表面滴加3 μL 0.5%（w/V） 壳聚糖溶液，在室温下过夜晾干，然后用超纯水清洗，N2吹干。将5 μL 20 U/mL的乙酰胆碱酯酶溶液和1 μL戊二醛（2.5%）混合液滴于电极表面，置于湿气盒中反应1 h，构建成乙酰胆碱酯酶和壳聚糖修饰的金电极（AChECHIT/Au）。 　　2.3对乙酰胆碱酯酶抑制剂的检测 　　实验原理如图1所示，将AChECHIT/Au电极浸在含有不同浓度马拉硫磷的磷酸盐溶液（PBS）中，室温下反应15 min，然后用PBS溶液冲洗干净，N2吹干。再在AChECHIT/Au修饰电极上滴加20 μL 纳米金生成液（0.05%（V/V）HAuCl43 mmol/L ATCl），室温下反应15 min，用超纯水清洗，N2吹干。再将电极置于1.0 mol/L NH3（1）AChECHIT/Au电极；（2）滴加纳米金生成液的AChECHIT/Au电极；（3）电沉积银的AuNPs/AChECHIT/Au电极。 　　（1） AChECHIT/Au； （2） AChECHIT/Au with the treatment of AuNPs growth solution；