大鼠UQCRFS1基因克隆及其表达模式分析.doc

大鼠UQCRFS1基因克隆及其表达模式分析 　　摘要：通过克隆获得泛醌-细胞色素C还原酶铁硫蛋白亚基1（Ubiquinol-cytochrome C reductase iron-sulfur subunit 1，UQCRFS1）基因，对基因序列及其编码的蛋白质进行分析，研究了其在大鼠（Rattus norvegicus）心、脑、肾、肺组织中的表达模式。测序结果显示UQCRFS1基因全长826 bp，RT-PCR结果显示其在大鼠心脏中表达量较高，脑和肺中表达量稍低，肾脏组织中表达量最低，推测UQCRFS1的功能可能与大鼠的心脏发育有关。 　　关键词：大鼠（Rattus norvegicus）；UQCRFS1基因；克隆；表达模式 　　中图分类号：Q786 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）09-2174-03 　　铁硫蛋白作为电子载体在生命活动中起着重要的作用，其特征是存在着铁硫簇，常见的铁硫簇中含2、3或4个铁原子，这些铁原子与多肽链相连，并由无机硫进行联结，由简单的铁硫簇通过金属联结组装成更复杂的结构[1-4]，铁硫蛋白正是基于铁硫簇而具有优异的电子传递功能。主要的铁硫蛋白包括细菌和线粒体呼吸链中的复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，光合作用中的光系统Ⅰ和铁氧还原蛋白，氮养菌中的固氮酶，Krebs循环中的顺乌头酸酶，以及哺乳动物中对铁的吸收起调控作用的铁调控蛋白Ⅰ等[5，6]。参与铁硫簇合成的关键蛋白已经被确定，但对其分子水平上的机制及如何进行相互作用在机体内外合成铁硫蛋白尚待进一步研究[7-9]。泛醌-细胞色素C还原酶铁硫蛋白亚基1（Ubiquinol-cytochrome C reductase iron-sulfur subunit 1，UQCRFS1）是线粒体呼吸链复合体Ⅲ中的一个亚单位，广泛分布在生物体中。目前对UQCRFS1基因的研究主要集中于阿尔茨海默病、心肌收缩疾病、亨廷顿舞蹈病、帕金森等相关疾病上。本研究根据前期工作所得的差异性片段，进行生物信息学分析后设计出特异性引物，克隆出大鼠（Rattus norvegicus）UQCRFS1基因的全长，进而研究该基因在大鼠心、脑、肺、肾发育过程中的表达动态，为探讨其在大鼠发育过程中的作用提供参考。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料与试剂 　　健康SD纯系大鼠，雌雄不限，购自新乡医学院实验动物中心。分别取1日龄、10日龄、20日龄健康SD大鼠的心、脑、肺、肾组织用作基因表达谱分析。Taq DNA聚合酶、pGEM-T Easy??体和DNA回收试剂盒均购自TaKaRa公司，反转录试剂盒购自Fermentas公司，PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 　　1.2 方法 　　2 结果与分析 　　2.1 UQCRFS1基因的克隆 　　2.1.2 UQCRFS1基因的序列测定结果 采用DNA回收试剂盒回收并纯化扩增得到的UQCRFS1基因，连接pGEM-T Easy载体，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性菌落提取质粒，对UQCRFS1基因测序，所得结果见图2。UQCRFS1基因全长826 bp，编码274个氨基酸。 　　2.2 UQCRFS1基因的表达模式分析 　　3 小结与讨论 　　不同结构的铁硫蛋白具有不同的生物学功能，主要包括参与电子传递、底物的结合与激活、铁/硫的存储、基因表达的调控、酶活力的调控等[10，11]。本研究克隆得到UQCRFS1基因，并根据测序结果得到其编码的氨基酸序列，利用相关的预测软件对该蛋白进行了结构和理化性质方面的分析。结果显示，UQCRFS1含有274个氨基酸残基，推测其分子式为C1306H2088N366O390S9，不稳定指数为46.87，表明其三维结构不稳定。预测UQCRFS1在哺乳动物网织红细胞中的半衰期为30 h，在酵母中的半衰期为20 h以上，在大肠杆菌中的半衰期为10 h以上。 　　对UQCRFS1基因在大鼠心、脑、肺、肾各组织中的表达模式进行分析，结果表明该基因在心脏组织中表达量较高，脑和肺组织中表达量稍低，肾脏组织中表达量最低，同时发现该基因的表达水平随组织的发育有上升趋势。可见UQCRFS1与大鼠心脏发育有关，但其在大鼠发育过程中的作用机制还不清楚，有待进一步的研究。 　　参考文献： 　　[1] REES D C. Great metalloclusters in enzymology[J]. Annual Review of Biochemistry， 2002，71（1）：221-246. 　　[2] FU W， JACK R F， MORGAN T V， et al. niFu gene product from Azotobacter vinelandii is