分子生物学考试复习总结题.docVIP

1.PCR的基本原理？答：PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理是依据细胞内DNA半保留复制的机理，以及体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，然后耐热DNA聚合酶以dNTP为原料使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。PCR全过程每一步的转换是通过温度的改变来控制的。需要重复进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即高温变性、低温退火、中温延伸３个步骤构成PCR反应的一个循环，此循环的反复进行，就可使目的DNA得以迅速扩增。DNA模板变性：模板双链DNA?单链DNA，94。退火：引物＋单链DNA?杂交链，引物的Tm值。引物的延伸：温度至70 左右， Taq DNA聚合酶以４种dNTP为原料，以目的DNA为模板，催化以引物３’末端为起点的5’3’DNA链延伸反应，形成新生DNA链。新合成的引物延伸链经过变性后又可作为下一轮循环反应的模板PCR，就是如此反复循环，使目的DNA得到高效快速扩增。答：通过DNA同源重组，使得胚胎干细胞特定的内源基因被破坏而造成功能丧失，然后通过胚胎干细胞介导得到该基因丧失的小鼠模型的过程称为基因敲除。1、打靶载体的构建：同源序列要足够长，要含有筛选用的标志基因。2、胚胎干细胞的体外培养3、打靶载体导入胚胎干细胞4、 同源重组胚胎干细胞的筛选5基因敲除胚胎干细胞注射入胚泡6胚泡植入假孕小鼠的子宫中7杂交育种获得纯合的基因敲除动物原核基因表达调控特点：RNA聚合酶只有一种，其σ因子决定RNA聚合酶识别特异性；操纵子模型的普遍性；阻遏蛋白与阻遏机制的普遍性（负性调节占主导）；转录和翻译偶联进行；转录后修饰、加工过程简单；转录起始是基因表达调控的关键环节。真核基因表达调控特点：RNA聚合酶有三种，分别负责三种RNA转录，每种RNA聚合酶由约10个亚基组成；活性染色质结构发生变化；正性调节占主导；转录和翻译分隔进行；转录后修饰、加工过程较复杂；转录起始是基因表达调控的关键环节。 （1）原核生物和真核生物基因表达调控的共同点： a 结构基因均有调控序列； b 表达过程都具有复杂性，表现为多环节； c 表达的时空性，表现为不同发育阶段和不同组织器官上的表达的复杂性； （2）与原核生物比较，真核生物基因表达调控具有自己的特点： a 真核生物基因表达调控过程更复杂； b 基因及基因组的结构特点不同，如真核生物基因具有内含子结构等； c 转录与翻译的间断性，原核生物转录与翻译同时进行，而真核生物该两过程发生在不同区域，具有间断性； d 转录后加工过程； e 正负调控机制； f RNA聚合酶种类多。DNA 甲基化是指胞嘧啶(C) 52位羟基的甲基化(m 5C) , 是一种DNA 复制后的酶促反 应过程. DNA 复制以后, 在DNA 甲基化酶的作用下, 将S2腺苷酰甲硫氨酸(SAM ) 分子上的甲基转移到DNA 分子中胞嘧啶残基的第5位碳原子上1随着甲基向DNA 分子的引入, 改变了DNA 分子的构象, 影响了DNA 与蛋白质因子(如拓朴异构酶、RNA 聚合酶、阻抑蛋白等) 的结合，因为高等生物CpG二核苷酸序列中的C通常是甲基化的，极易自发脱氨，生产胸腺嘧啶，所以CpG二核苷酸序列出现的频率远远低于按核苷酸组成计算出的频率。由于这些CpG二核苷酸通常成串出现在DNA上，因此这段序列往往被称为CpG岛。DNA甲基化会抑制基因转录，DNA甲基化会导致某些区域DNA构想变化，从而影响了蛋白质与DNA的相互作用，抑制了转录因子与启动区DNA的结合效率。当组蛋白H1和含CCGG序列的甲基化或非甲基化DNA分别形成复合体时，DNA的构型存在很大差异，甲基化达到一定程度是会发生从常规的B-DNA向a-DNA的过渡，由于a-DNA结构收缩，使许多蛋白质赖以结合的部件缩为大沟而不利于基因转录的起始。DNA甲基化与X染色体失活：哺乳动物中，雌性体细胞内存在两条x染体，而在雄性体细胞内只存在一条x染色体，这就要求必须对不同数量的x染色体进行剂量补偿，使雌性个体中的一条x染色体失活。失活的x染色体保持低转录水平与滞后复制，其与结构性的异染色质相似，但在看家基因启动子的Gpc岛处发生了甲基化。x染色体失活可以防止雌性个体体内双倍x基因发挥功能，从而维持雌性体细胞正常的生长发育。哺乳动物中Gpc岛胞嘧啶的甲基化与x染色体失活密切相关，若GpC岛甲基化缺失，x染色体失活状态将不稳定。研究表明，x染色体失活是由x失活中心顺式控制的，包括启动、计数、选择、建立与维持等复杂的过程。x染色体失活一旦建立则保持稳定，其所有的子细胞均失活同一条x染色体。当一个卵子与精子形成一个雌性胚胎时，x特异性失活转录本可以通过