As2O3及联合紫杉醇对胃癌MGC803细胞生长和耐药性影响.docVIP

As2O3及联合紫杉醇对胃癌MGC803细胞生长和耐药性影响 　　[摘要] 目的 研究三氧化二砷及联合紫杉醇对胃癌细胞株MGC803的生长和耐药性变化。 方法 MTT法观察MGC803细胞的生长变化；免疫组化检测p-gp，bcl-2蛋白的表达；电镜观察超微结构变化。 结果 随着As2O3或联合紫杉醇作用时间的延长，对肿瘤细胞的抑制率逐渐增强，除0.5 μmol/L As2O3作用外，其余各组随药物浓度的升高，其抑制率就越高，与对照组比较有明显差别（P 　　[关键词] 三氧化二砷；紫杉醇；MGC803细胞；生长抑制；耐药性 　　[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）29-0004-03 　　胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤，全世界每年有90万新发病例，其中我国每年新发胃癌约40万，占全世界的42%，居所有恶性肿瘤之首，总发病率有上升趋势[1，2]，胃癌化学治疗的效果不甚理想，目前除5-氟尿嘧啶外其他化疗药物对胃癌效果不佳，且多数化疗药有较强的毒副作用和耐药性问题[3]，因此必须致力于寻找新的化疗药物和方法。As2O3是中药砒霜石的主要成分，具有显著的抗肿瘤细胞作用，其作用机制主要是诱导肿瘤细胞凋亡、调控细胞周期、抑制癌细胞生长及诱导细胞分化等[4]，已有研究表明As2O3对多种实体肿瘤都有疗效，能体外诱导肝癌、胃癌和横纹肌肉瘤细胞凋亡和坏死[5]，中药紫杉醇（paclitaxel， PA）能促进细胞的微管蛋白聚合，抑制解聚，从而抑制细胞有丝分裂，是临床重要的化疗增敏剂，本研究将两者协同作用于人胃癌MGC803细胞，国内文献报道甚少，观察在增敏剂紫杉醇辅助下，As2O3对胃癌细胞的生长抑制作用和对耐药性的影响，探讨可能的机理，为As2O3临床应用和药物配伍提供依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料与试剂 　　三氧化二砷（As2O3）购自哈尔滨伊达药业有限公司，紫杉醇系Sigma公司生产，RPMI-1640和胎牛血清由Gibco/BRL公司提供，MTT由上海华舜生物有限公司生产，人胃癌MGC803细胞由哈尔滨医科大学附属第一医院提供， p-gp，bcl-2免疫试剂盒由博士德公司生产，恒温培养箱，由苏州安泰技术有限公司生产，透射电镜EM208由荷兰生产，OLYMPUS（IX50-S8F2）倒置显微镜，酶标仪（型号SAFIRE2）由奥地利生产。 　　1.2 细胞培养 　???MGC803细胞接种于50 mL培养瓶中，加入RPMI-1640 培养液（含热灭活胎牛血清，2 g/LNaHCO3，青霉素和链霉素各100 mg/L）中，置于37℃，5%CO2 浓度及饱和湿度恒温细胞培养箱中培养，细胞为贴壁上皮样生长，用0.15%胰蛋白酶消化传代，以培养液吹打制成单细胞悬液，取对数生长期细胞用于实验。 　　1.3 实验分组及其药物处理 　　将5×104个/mL单细胞悬液接种于96孔培养板中，阴性对照组加入10 %的完全培养液，实验剂量组分别加入0.5 μmol/L、1.5 μmol/L、2.5 μmol/L的As2O3培养液，以及As2O3和PA混合液（上述各As2O3浓度分别加入2 μmol/L的紫杉醇），每隔3天更换一次培养液，在不同时间取出细胞做实验。 　　1.4 MTT法测定细胞生长抑制率 　　96孔培养板内加入5×104个/mL单细胞悬液，3℃，50 mL/L CO2孵箱中培养24 h，24 h后弃去培养液，分别加入药物（不同浓度的As2O3，不同浓度As2O3+PA混合液）200 μL/孔，同一浓度设3复孔，同时设3孔阴性对照，加入等体积的PBS，放入37℃、5% CO2培养箱中培养。在培养24、48、72 h后，各取出一个培养板，吸去上清液，每孔加入无血清的培养液180 μL及20 μl MTT液（用PBS配成50 mg/mL），37℃孵育4 h，弃去上清液，每孔加入150 μL 1 %的DMSO，在微量振荡器上低速振荡10 min，酶标仪测量各孔的吸光度值（A 值），按公式抑制率=（1-A 用药组/ A 细胞对照组）×100%计算，绘制细胞生长抑制曲线。 　　1.5免疫组化检测p-gp，bcl-2蛋白的表达 　　收集上述对数生长期的MGC803细胞，用0.1%胰酶消化成单细胞悬液后，以1×105/mL细胞浓度接种在放有玻片的24孔培养板中，在37℃，5%CO2孵箱中培养24 h后，加入各药物（浓度同前），对照组则加入等容量的培养液，继续培养72 h后（研究显示第三天抑制作用最强），吸尽上清液，PBS洗3次，取出玻片，中性树胶封片（有细胞面向上），过夜晾干，4 ℃保存备用，免疫组化按试剂盒说明书进行操作，结果判定，排除爬片边缘的细胞，10×10的