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实验十一 聚合酶链式反应（PCR） 和随机扩增多态性DNA（RAPD） 实验目的 学习和掌握PCR实验原理和技术。 理解RAPD的原理，学会运用RAPD进行遗传分析。 实验原理 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）的原理是类似DNA天然复制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经高温变性、低温退火和中温延伸3个阶段，若干个循环后，DNA扩增2n倍。一般经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。 随机扩增多态性DNA（Random Amplification Polymorphic DNA）是建立在PCR技术之上的一种分子标记方法，它是以一系列不同随机排列的寡聚核酸单链为引物，对于所研究的基因组DNA进行扩增，扩增产物通过聚丙烯酰氨凝胶或者琼脂糖凝胶电泳分析，经EB染色来检测扩增产物的多态性。对于任一特定的RAPD引物，它同基因组DNA序列有特定的结合位点，这些位点在基因组某些区域内的分布符合PCR反应的条件，即随机引物在模板的两条链上有互补的位置，且引物的3’端相距在一定的长度范围之内，就可以扩增出来DNA片段，如果基因组在这些区域发生DNA的片段的插入或者缺失，或者碱基突变就能够导致这些特定结合位点分布发生变化，而使PCR产物增加或者减少，发生分子量的变化，通过对于PCR产物的检测分析即可以测出基因组在这些区域的多态性。 实验材料 三种山茶花DNA模板 用具和药品 PCR管，PCR热循环仪，移液枪，吸头，琼脂糖电泳系统，凝胶成像仪；4种dNTP，引物，Taq聚合酶，Buffer，MgCl2，DNA Marker，琼脂糖。 实验步骤 1、反应体系配制 采用三种山茶花DNA作为模板，分别用5种RAPD随机引物进行PCR扩增。先在PCR管配制20ul的反应体系： 2、PCR扩增 将配好PCR管装入PCR热循环仪进行扩增，扩增程序：93℃预变性4min；93℃变性4min——35℃退火1min——72℃延伸2min，共45个循环；72℃延伸10min。 3、电泳 吸取7 ul PCR产物、2 ul溴芬蓝载样缓冲液，加样到1.2 %琼脂糖凝胶上，5v/cm电泳1h后，在凝胶成像仪中观察电泳谱带，并照相记录。 4、数据处理与统计分析 用“1”(有) 和“0”(无) 记录谱带，把图形资料转换成数据资料。根据Jacard相似系数法，求得品种i 和j 之间的遗传相似性系数(F)，再根据D=1-F, 用SPSS软件进行聚类分析，构建分子进化系统树，进行遗传多样性和遗传关系分析。 作 业 做好实验记录，计算各品种之间的遗传相似性系数(F)，并用软件做出聚类分析图。 分析山茶花的遗传多样性，和三种山茶花之间的遗传关系。 * * 12.2 ul 无菌双蒸水 1.0 ul 0.5 umol/L 10 umol/L 引物Primer（不同） 0.2 ul 1unit 5unit/ul Taq DNA聚合酶 1.2 ul 1.4 mmol/L 25 mmol/L Mg Cl2 1.4 ul 500 umol/L 10 mmol/L 4种dNTP混合物 2.0 ul 1 10× 缓冲液Buffer 1.0 ul 100 ng 100 ng/ul 模板DNA（不同） 加入量 PCR体系浓度 母液浓度 反应物