关于细胞培养.docVIP

贴壁细胞消化传代时通常采用两种方法：一、加入胰酶等细胞脱落后，再加培养基中止胰酶作用，离心传代；二、加入胰酶后，镜下观察待细胞始脱落时，弃胰酶，加培养液分瓶。但前者太麻烦，而后者有可能对细胞施加胰酶选择，因为总是贴壁不牢的细胞先脱落，对肿瘤细胞来说，这部分细胞有可能是恶性程度较高的细胞亚群。  介绍一种简单的消化传代方法和各位共享。加入PBS洗去血清或加入胰酶先中和血清的作用（30s），弃之，再加入适量胰酶作用10s-40s（根据细胞消化的难易程度），弃之，这样依赖残余的胰酶就可将细胞消化单细胞。 1、洗去血清 2、加1/5V PBS/D-Hank‘s，2到3次 3、1/10V 胰酶 4、镜下观察，见突起缩回（细胞间隙增大）即加含血清培液 5、吹打后（加培液） 6、分种  对于较难消化的细胞，可以用2%利多卡因消化5-8分钟，然后再弃去，加培养基吹打也可以，对细胞的影响不大。 1、弃去旧培养液，PBS或D液清洗2－3遍（除去旧培养液中血清的影响）； 2、加入0.125% (0.25%也可以) 胰酶6滴（25cm2的培养瓶），使胰酶刚刚可以布满整个底； 3、作用1min左右,用含10%血清的培养液3-5ml中和； 4、轻柔吹打细胞脱壁, 离心。  赞同不用PBS也不用Hanks洗，只要把旧培养液吸的干净一点，直接加酶消化应该不会有什么问题。 对付难消化细胞的做法是弃取培养液后，用0.04%的EDTA冲洗一次，再用1/4v的0.04%的EDTA室温孵育5min，弃取大部分EDTA，加入与剩余EDTA等量的胰酶（预热）总体积1/10v。消化到有细胞脱落。不过有人说EDTA对细胞不好。  EDTA对细胞有损伤作用，一般在难消化的细胞才和胰酶合用，用了EDTA后把细胞离心后洗几遍洗去EDTA。 首先，EDTA对细胞肯定有伤害，EDTA可以与细胞膜上很多大分子蛋白上的中金属成分发生螯合，致使蛋白变性影响蛋白质的生物活性而发生损伤。  但是，这种损伤是可逆的。就细胞传代所用的浓度和时间条件下，还不致对细胞产生过大影响。其实Hyclone的胰酶中就有EDTA。  因此在一般细胞操作中不能用TE代替PBS洗细胞。  如果EDTA对细胞的伤害不是可逆的，想象一下，过去重金属中毒时用EDTA解毒岂不是又喝了一种毒药！ 培养的BASMC：倒掉旧培养液，加入少量胰酶冲一下，倒掉，再加入0.125-0.25%胰酶约6-10滴或1ml（25ml bottle）消化，再加入适量新培养基中和，并分瓶 这种方法简单、省事；效果很好并且不损失细胞！ 问题1：  我的细胞消化要用EDTA加胰酶消化20分钟，有什么好办法？ 解答1：  先用PBS把细胞洗两遍，使瓶内没有血清了，减少对胰酶的中和，然后用新配的0.25%的胰酶加入3ml左右，放在37度，然后可以在细胞有些消化下来时，拿着瓶口，运用手腕的力量轻轻震荡瓶内液体，这样细胞很快就下来了，还不需要吹打，分散也均匀 问题2：  消化细胞后都用什么洗涤呀？带血清的PBS，还是直接用PBS，或者是用培养液呀？我原代培养的细胞二次接种后总是有些细胞铺不开，有些又铺很好，不知是什么问题，求教一下解答2：  不管是进口血清或是国产血清，都用PBS直接冲洗三次即可，没有必要用DMEM或加血清的培养液。见意你查查胰酶消化的原理，本论坛中就有，加了血清胰酶怎么消化呀。   细胞铺不开，原因有二：一是消化时离心管中的细胞没有吹打开，解决方法是离心后的细胞加3ml左右的培养基，用吸管轻轻吹打，吹打开后，再加培养基，这样细胞不会成团，培养基太多，细胞不容易吹打开。二是接种时，培养瓶中先加培养基，再接种细胞，接种后轻轻晃动摇匀。先加细胞后加培养基或不晃动摇匀，其结果就是细胞铺不开。  养MSCs，传代时候胰酶消化过后，用加血清的培养液终止消化，再离心。弃上清夜，再加入含血清培养液，重悬浮细胞，吹打均匀，计数，安所需密度接种。先用少量培养液，比如1到2ml，润湿培养瓶，然后再接种细胞原因是如果直接接种细胞的话，肯定有的地方接触了较多培养液，而有的地方几乎就没有培养液，细胞当然不会在没有营养的地方待着了。  总之，先用少量培养液润湿应该是一个解决办法。 我们的观点为： 1、不洗的细胞传代后，次日一般要换液一次，除去没有贴壁的死细胞．如果是悬浮生长的细胞则不用处理。 2、用离心洗涤来出去残留胰酶是不必要的，增加污染机会，也造成细胞丢失，还会使些一些细胞死亡。 问题3：  以前一