第五章核酶与抗体酶2010PPT.ppt

（三）核酶在医学上的应用 1、核酶抗肝炎病毒的研究 目前人们已进行了核酶抗甲肝、乙肝、丙肝等病毒的研究。人工设计核酶多为锤头状结构，少数是采用发夹状核酶。 2、抗人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-Ⅰ)核酶 1998年，美国加利福尼亚大学Wong-Staal等利用发夹核酶抑制HIV-Ⅰ基因表达，并率先进入临床Ⅰ期。 3、抗肿瘤治疗 核酶能在特定位点准确有效地识别和切割肿瘤细胞的mRNA,抑制肿瘤基因的表达，达到治疗肿瘤的目的。 五、核酶技术面临的问题 1、核酶催化切割反应的可逆性问题； 2、提高催化效率； 3、寻找合适载体将核酶高效、特异地导入靶细胞； 4、使核酶在细胞内有调控地高效表达； 5、增强核酶在细胞内的稳定性； 6、对宿主的损伤问题有待进一步考察。 六、展望 核酶技术作为一种很有希望的基因治疗手段, 尽管还有许多上述问题有待解决, 但 20 年来已取得巨大的发展。上述问题的解决, 无疑将使核酶应用于临床的时间进一步缩短。虽然核酶抗病毒、抗肿瘤作用目前多处于实验研究阶段, 但已经露出了希望的曙光。 随着全球科技工作者的进一步努力, 核酶抗病毒、抗肿瘤的治疗一定会有光辉的前景。 第二节 脱氧核酶 一、概述 长期以来,DNA一直被认为是一种较为被动的分子,仅仅充当了遗传信息的载体,并起复制、转录遗传信息的功能。 Cech等在1987年首次发现了RNA具有酶的催化效应,称为核酶。对核酶的结构及应用研究逐步深入,揭示了其特异性催化机制。这一发现突破了“酶都是蛋白质”的传统概念,使人们开始对遗传物质DNA有了新的认识。 随着分子生物学和体外分子进化技术的发展,一些实验室发现单链DNA分子同样具有酶活性,这些具有催化功能的DNA分子称为脱氧核酶(DNAzyme),又称酶性DNA,在一定条件下可切割RNA分子特定位点内部的磷酸二酯键。 脱氧核酶的发现进一步延伸了酶的概念。 自1994年首次发现脱氧核酶以来,迄今已发现了几十种脱氧核酶。根据其功能可分为7大类: 具有RNA切割活性; 具有DNA连接酶活性; 具有卟啉金属化酶和过氧化酶活性; 具有DNA水解活性; 具有DNA激酶活性; 具有N2糖基化酶活性; 具有DNA戴帽活性。 其中最特别的是具有RNA切割活性的脱氧核酶,它能催化RNA特定部位的切割反应,从mRNA水平对基因灭活,从而调控蛋白质的表达,可能成为对抗病毒感染、肿瘤等疾病的新型基因治疗药物和基因功能研究、核酸突变分析等的新型核酸工具酶。 1、具有RNA切割活性的脱氧核酶的结构与特性 Santoro等从包含约1014个随机DNA文库中筛选出两条高效、通用的脱氧核酶: 10-23型DNAzyme(10-23 DRz) 8-17型DNAzyme(8-17 DRz) 10-23 DRz是第10 轮扩增第23个克隆,由15个脱氧核糖核苷酸构成一个环状催化中心,两侧臂各有8个脱氧核糖核苷酸构成酶分子的底物识别部位,其碱基序列与底物通过碱基配对的形式紧密结合。底物识别部位的特殊序列构成提供了特异性底物结合信息,能把DNAzyme的催化性碱基环固定到RNA底物分子上。 10-23型脱氧核酶作用机理 R Y R RNA substrate 切割点 R=A or G Y=C or U deoxyribozyme 5? 3? 10-23DRz 的切割位点位于RNA分子上的未配对的嘌呤(A)和配对的嘧啶(U)之间,切割RNA后可产生(3′)-环磷酸和5′-羟基未端的切割产物。通过合理设计DNA酶底物识别部位的核苷酸序列,就能对任何含有嘌呤、嘧啶的RNA分子进行切割。 8-17DRz中带有不配对的“ wobble” 成分,即位于切割点相邻处的rG－dT非配对碱基。8-17DRz要求的切割位点为AG连接,因此在RNA灭活研究中,10-23DRz更灵活,应用更广。 脱氧核酶最主要的特性: 高效催化性 高度专一性(由碱基配对所决定), 稳定性好 分子量小 价格便宜等 容易合成 切割位点选择的限制更少 通过合理设计DNAzyme底物识别部位的核苷酸序列,就能对任何含有嘌呤、嘧啶的RNA分子进行靶向切割,从而调控蛋白质的表达。 2、具有RNA切割活性的脱氧核酶的应用 脱氧核酶将高效的催化降解能力与反义的靶向识别能力结合,使得其应用从基础生物技术领域扩展到医疗领域,在序列特异性RNA降解方面具有广阔的应用前景,在生物体外可以作为RNA的限制性内切酶,在体内可在mRNA水平