第三章基因克隆1PPT.ppt

第三章　基因克隆载体;载体（vector）;问题;载体起什么作用？ (1) 为外源基因提供进入受体细胞的转移能力。; 从理论上讲，任何DNA分子均可以物理渗透的方式进入生物细胞中，但这种频率极低，以至于在常规的实验中难以检测到。某些种类的载体DNA分子本身具有高效转入受体细胞的特殊生物学效应，因此由外源基因与载体拼接所形成的DNA重组分子传入受体细胞的机率比外源DNA片段单独转化提高几个数量级. ; 外源基因进入受体细胞后面临两种选择，或者直接整合在受体细胞染色体DNA的某个区域内，作为其一部分而复制并遗传，或者独立于受体细胞染色体DNA而存在，在这种情况下，载体DNA分子必须为外源基因提供独立的复制子功能，否则外源基因不可能在受体细胞由复制和遗传. ; 外源基因的扩增依赖于载体分子在受体细胞中高拷贝自主复制的能力，这种能力通常由载体DNA上的若干相关基因编码，同时，外源基因高效表达所需的调控元件一般也由载体分子提供。应当指出的是，上述三大功能并非所有的载体分子都必需具备的，DNA重组克隆的目的不同，对载体分子的性能要求也不同。 ;克隆载体的DNA分子必须具备的条件;6.具有合适的选择性标记，可以很方便地知道外源DNA已经插入，以及把接受了载体的受体细胞选出； 7.具备较多的拷贝数，易与宿主细胞的染色体DNA分开，便于分离提纯； 8.具有促进外源DNA表达的调控区。 9.克隆载体必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物的细胞，尤其是人的细胞。;问题; 载体由多种不同的部分 (称为元件)组成，如复制区、启动子和抗性基因等，它们可以分别取自细菌质粒、噬菌体DNA或病毒DNA等。按照基本组成元件的来源不同，可以将载体分为质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、黏粒载体、病毒载体和人工染色体载体等各种类型。 ;第一节　质粒载体;;一、质粒（plasmid）的基本特征;　　;cDNA(cDNA complementary DNA)是由mRNA通过反转录酶合成的双链DNA cccDNA（covalently close circular）天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA ;; 对于未进行酶切的质粒来说，常会出现两条??泳带，一条是（松弛）螺旋状质粒DNA带，另一条是超螺旋状质粒DNA的带，以超螺旋状质粒DNA居多，移动速度也最快。有时还会出现三条带，其中一条是因为有一些质粒DNA在提取过程中遭到损伤而线性化，其移动速度介于螺旋状和超螺旋状质粒DNA之间，所以该条电泳带也位于上述两种带之间。如果提取的质粒很好时，这条带会很弱，有时看不到。;Relaxed circle;质粒的类型：按分子特性分成接合型和非接合型，接合型的质粒，又叫自我转移的质粒，带有自主复制所必须的遗传信息之外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。 按表型特性分成F质粒、R质粒、Col质粒。;质粒所带的基因通常有利于宿主细胞。例如基因的产物是某些抗生素或对某些抗生素的抗性、能降解某些复杂的有机化合物、产生大肠杆菌素和肠毒素、产生限制酶或修饰酶等。; 细菌质粒中对其遗传、行为和分子性状等研究得最早最详细的，是大肠杆菌致育因子(fertility factor)，也叫F因子。是在某些大肠杆菌细胞中发现的一种最有代表性的单拷贝的接合型质粒，具有这种质粒的细菌可形成特殊的表面物质-性纤毛，借此与其他细菌接触并发生接合，此时便能将质粒基因组DNA传递给对方。接合质粒大多发现于肠道细菌和相近的革兰阴性菌中。 ;F质粒:又叫F因子，即致育因子(fertility factor)的简称，是在某些大肠杆菌细胞中发现的一种最有代表性的单拷贝的接合型质粒，其分子量约为94kb左右，总共编码着19个转移基因(tra)。在寄主细胞中，F质粒有三种不同的存在方式： ; (i)以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，其上不带有任何来自寄主染色体的基因或DNA区段。这样的细胞叫做F＋细胞。 ;(ii)　以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，同时在其上还携带着细菌的染色体基因或DNA区段。这样的细胞叫做F’细胞。; (iii)以线性DNA形式从不同位点整合到寄主染色体上，这样的细胞叫做Hfr细胞 (高频重组细胞)。;第二个研究历史较长的质粒是产生大肠杆菌素因子 (Col因子)。这是在1952年前后，发现大肠杆菌能产生一种奇怪的蛋白质性抗菌物质，称之为大肠杆菌素而被人们开始研究的。后来查明，这种大肠杆菌素是由性状与F因子很相似的Col因子支配产生的Col质粒。 ; 1959一1960年，在日本发现了耐药性因子 (R因子)，它具有为某