植物细胞悬浮培养PPT.pptVIP

要求：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎 悬浮系的建立与培养 callus 150~250ml flask centrifuge isolation subculture 1g/10ml medium 100~120 rmp culture transfer 1 time/3d 80 rpm 成功的悬浮细胞培养体系特征 悬浮培养分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞以下。 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。 细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天便可增加一倍。 悬浮细胞的生长动态 悬浮细胞生长的衡量 根据不同培养时间的细胞数变化，或细胞质量变化。 生长速率(p)：不同时间细胞密度(x)的自然对数与起始密度(x0)的自然对数之差与培养时间(t)的比值 p＝(lnx-lnx0)/t 鲜重：真空减压过滤后称重，反应细胞生长情况 干重：鲜细胞烘干至衡重，反应细胞质量 植物细胞培养制药 意义 药用植物是天然药物的宝库 植物细胞培养是生产药物的可能途径 目前采用植物细胞培养生产的药物主要包括 （1）苷（甙）类：包括皂苷（人参皂苷、三七皂苷、柴胡皂苷、著芋皂苷等）、强心苷（强心醇苷、毛地黄毒配质衍生物等）、甘草甜苷、香豆精苷等。 （2）甾醇：包括菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、胆甾醇、异岩藻甾醇等。 强心苷类（侧链为不饱和内酯环） 甾醇 （3）生物碱：吡啶、喹啉、异喹啉等。 （4）醌类：包括蒽醌、萘醌等。 （5）蛋白质类：胰岛素、氨基酸、蛋白酶抑制剂。植物病毒抑制剂、植物抗生素等。 （6）黄酮类：具有C6-C3-C6结构，生物合成前体是苯丙氨酸和丙二酸单酰辅酶A。多为治理心血管疾病和高血压的药物成分。 小檗碱 蒽醌 黄酮 植物细胞培养制药进展 第一个专利： 1956年Routin和Nickell首次数提出利用植物细胞培养技术生产天然产物的第一个专利 工业植物生物技术 ：20世纪90年代明确提出 已经从 200余种药用植物获得了愈伤组织或细胞悬浮培养物（傅经国等，2004） 国际 日本 ：紫草 人参 红豆杉 欧美 ：美国－红豆杉； 德国－紫锥菊 国内：罗士韦 叶和春 郑光植 侯嵩生 丁家宜 利用途径生产次生代谢产物的优点 不受季节、环境、病虫害影响. 不占耕地，适用于贫瘠的地方 代谢产物生产可以在可控条件下进行,可以通过细胞株筛选、特定生物转化途径与代谢调控提高目标产物含量. 植物细胞培养 是在离体条件下，将分离的植物细胞通过继代培养增殖，获得大量细胞群体的一种技术。 是人工种子、原生质体培养、花药培养等的支撑技术。 植物细胞培养的特点: ⑴大小; ⑵细胞团的形式存在; ⑶纤维素细胞壁和大液泡,易被剪切力损伤; ⑷生长缓慢 ⑸培养基成分丰富而复杂,易被微生物污染; ⑹需光、氧、二氧化碳 培养类型 按培养对象来说，可分为原生质体培养和单细胞培养； 按培养基类型可分为固体培养和液体培养； 按培养方式可分为悬浮细胞培养和固定化细胞培养 。 植物单细胞分离和初步培养 单细胞获得： 机械法；酶解法；愈伤组织法 单细胞培养： 平板培养(plating culture) 看护培养法（nursing culture) 饲养层培养(feeding layer culture) 单细胞分离方法 机械法 具体做法： 将叶片轻轻研碎、过滤离心、收集净化 从未分化的疏松易碎的愈伤组织，通过摇床振荡获得分散的单细胞或小细胞团 优点： 细胞不受酶伤害； 有利于进行细胞的生理和生化研究。 单细胞分离方法 酶解法 酶对细胞壁有一定的软化作用，所以采用酶法时，必须加入甘露醇等渗透压保护剂；可通过加入硫酸葡聚糖钾来提高游离细胞的产量。 酶解法的优点 可获得较多的叶肉游离细胞（但对禾本科植物叶片效果不好）。 细胞平板培养（plating culture) 指将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术。Bergman(1960)首创 单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不能超过6个细胞。 单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤2次以后，调整密度为5×103个/毫升 植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀地平铺于培养皿中，其厚度为5mm左右。 细胞平板培养（plating culture) 平板培养的效果一般用植板率来衡量。植板率是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞总和中所占的比例。 每个平板形成的细胞团数 植板率＝ 每个平板接种的细胞总数 细胞平板培养