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选修课 临床检验 9荧光定量PC在临床实验室诊断中的应用
荧光探针定量PCR技术在临床 实验室诊断中的应用 重庆医科大学附属第一医院检验科 胥飚 38,200,000 (PCR) 8,800,000 (周杰伦） 内 容 提 要 一、基因诊断技术在医学检验中的地位 二、荧光探针定量PCR的技术特点 三、荧光探针定量PCR在临床医学中的应用 临床实验医学发展 三个时代 标志技术 性质 生化诊断时代 生化分析 表象 免疫学诊断时代 酶免、放免 表象 分子(基因)诊断时代 基因体外扩增(PCR) 本质 基因诊断技术的发展及在临床诊断中的地位 基因诊断（分子诊断）：以核酸作为诊断的物质基础 主要包括： 遗传性疾病 有遗传趋向疾病的连锁分析 疾病及肿瘤易感基因的分析 病原体的检测 亲子鉴定和个人认定 人类基因组计划（HGP）与基因诊断 基因诊断技术：PCR技术为其标志性技术 荧光探针定量PCR的技术特点 第一代PCR技术：变性、退火、延伸 结果判断：电泳 缺点：假阳性（污染）、 假阴性（灵敏度低） 定性检测 第二代PCR技术：常规PCR+探针 例如：荧光探针PCR技术 PCR--ELISA 荧光探针定量PCR技术的原理及过程 分 子 学 基 础：常规PCR+荧光探针（TaqMan荧光探针 ) 酶 学 基 础：Taq酶的5’ 3’外切核酸酶活性 荧光化学基础：荧光报告基团和淬灭基团标记探针 荧光共振能量转移原理 (FRET ) Ct值：C代表Cycle，t代表threshold，其 含义是：每个反应管内的荧光信号到达 设定的阈值时所经历的循环数。 荧光定量PCR技术的主要优点 一、真正的样品原始核酸模板的准确定量 二、定量范围宽（0—1010/ml)，无需梯度稀释 三、封闭状态检测，避免扩增产物污染 四、探针使用使特异性更强 五、光谱分析技术使敏感性更高 六、仪器读数，结果判断客观真实 七、无需PCR后处理，操作更简便、快速 八、数据电脑管理，利于医院管理 荧光定量PCR技术检测的报告形式 一、报告形式： 荧光定量PCR检测的报告以：“拷贝数”（copy) 二、拷贝数的意义： 表示原始标本内可供探针结合的核酸片段数量。 三、拷贝数与病原体的关系： 拷贝数与病原体的数量成正相关 一般来说：细菌是单拷贝的，病毒是多拷贝的。 检测结果分析 荧光定量PCR检测结果的正常值？ 外源基因：正常值：0拷贝 0拷贝：根据临床表现 内源基因：正常值：参照正常细胞相关基因表达水平 FQ-PCR在临床医学中的应用 1、病原体的定量检测； 2、肿瘤基因和肿瘤标志物表达(mRNA)的检测； 3、遗传病基因的检测； 4、与疾病相关的各种蛋白质（细胞因子、酶、 激素、受体）的基因表达的定量检测； 5、药物疗效的考核手段。 6、建立病原体的分子诊断标准 FQ-PCR在病原体检测中的应用 一、肝炎病毒定量检测 二、优生优育相关项目检测 三、结核杆菌及呼吸道病原体检测 四、性病病原体检测 129例HBV定量检测结果 ELISA 总数 阳性例数 阳性率 平均数量 范围 大三阳 81 81
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