肝素酶siRNA联合亚砷酸抑制胰腺癌侵袭性实验研究.docVIP

肝素酶siRNA联合亚砷酸抑制胰腺癌侵袭性实验研究 　　 　　摘 要：目的：观察Hpa小干扰RNA（small-interfering RNA, siRNA）联合亚砷酸对胰腺癌侵袭力的影响，为Hpa-siRNA联合亚砷酸治疗胰腺癌提供实验依据。方法：将3条Hpa干扰靶序列Hpa1-siRNA，Hpa2-siRNA，Hpa3-siRNA稀释退火，分别与线性化pGenesil-1.1 质粒表达载体的连接制成pGenesil1.1/Hpa1-siRNA、pGenesil1.1/Hpa2-siRNA、pGenesil1.1/Hpa3-siRNA等重组质粒。然后将上述目的基因转染SW1990胰腺癌细胞，并设空白对照和阴性对照组。RT-PCR检测转染后Hpa-mRNA表达，Western blot检测转染后Hpa蛋白表达。采用Transwell小室试验检测转染后Hpa-siRNA和经亚砷酸处理SW1990细胞体外侵袭能力。结果：Hpa-mRNA和Hpa蛋白在基因转染前后的表达，NC和HK组无明显差别，Hpa1-siRNA，Hpa2-siRNA，Hpa3-siRNA三组均明显下降，Hpa2-siRNA抑制效率优于Hpa1-siRNA和Hpa3-siRNA（P 　　 因此，Hpa基因有望成为胰腺癌生物治疗的新靶点。另外，一些研???发现\[7-12\]，亚砷酸对多种恶性肿瘤的侵袭和转移性尚具有明显抑制作用。因此我们观察Hpa-siRNA联合亚砷酸对胰腺癌侵袭联合抑制效果。从而为将来亚砷酸联合Hpa-siRNA治疗胰腺癌患者提供理论基础和实验依据。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　 pGenesil-1.1质粒和大肠杆菌DH5α菌株由武汉晶赛生物有限公司构建和制备。胰腺癌SW1990细胞株购自中国科学院上海细胞库。亚砷酸冻干粉（10mg/支）由北京双鹭药业股份有限公司馈赠。Hpa基因序列自行设计，序列为：Hpa-F 5- GAAAGACGGCTAAGATGC -3 Hpa-R5- AAATGGTAGTTTCCTGCTC -3 扩增片段大小为361bp。GAPDH452内参引物为：序列为GAPDH452-F 5- ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 GAPDH452-R 5- TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 扩增片段大小为452bp。紫外分光光度计（SHIMADZU），DNA Marker、Eco31I内切酶、SacI内切酶和T4DNA Ligase链接酶(TaKaRa)， 质粒小抽试剂盒（北京博大泰恒生物技术有限公司），水平电泳仪 DYY-III（北京六一仪器厂），胶回收试剂盒（北京博大泰恒生物技术有限公司），动物RNAout（天泽基因工程有限公司产品），ReverTra Ace-α-TM-RT-PCR Kit （东洋纺上海生物科技有限公司），PCR引物（武汉博洁公司），PCR system 2700(美国AB公司GenAmp)，Taq DNA 聚合酶（MBI 公司），HRP标记的羊抗兔IgG和 Rabbit anti-Hpa抗体（武汉三鹰），Rabbit anti-GAPDH多克隆抗体（武汉晶赛），PVDF膜（Life Science, USA），SuperSignal化学发光试剂（Pierce, USA），Transwell小室(CORNING)。 　　 [WT5”FZ〗中华中医药 学刊 　　1.2 方法 　　1.2.1 目的基因设计、合成、与质粒连接、酶切 通过Pubmed网站有哪些信誉好的足球投注网站目的基因人肝素酶mRNA序列，并确定基因号为NM_001098540（1779 bp）或NM_006665（1810 bp）为本实验的目的基因。委托武汉晶赛生物有限公司设计挑选3条靶序列和干扰序列dsDNA模板引物，分别命名为Hpa1、Hpa2、Hpa3，引物结构：CACC+Sense+Loop+Antisense+终止信号+SacI。用30μL annealing buffer 溶解上述合成1OD Hpa1/Hpa2/Hpa3单链目的基因片段。取2μL（即2μL Hpa1/Hpa2/Hpa3A +2μL Hpa1/Hpa2/Hpa3-B）+16μL annealing buffer混匀。94℃水浴退火自然冷却至室温。取1μL退火产物+99μL H2O做100倍稀释。将稀释退火片段分别与线性化载体pGenesil-1.1的连接，分别命名为pGenesil-1.1/Hpa1-siRNA、pGenesil-1.1/Hpa2-siRNA、pGenesil-1.1/Hpa3-siRNA。各取5μL过夜连接产物转化感受态细胞DH5α，分别涂布于含卡那霉素抗性（终浓度为30μg/mL）的LB平板上，37