第三章 载体与宿主的选择PPT.ppt

第三章 基因工程载体及宿主;第一节 用于基因克隆的载体;1 载体的功能及特征;载体应具备的条件;2 质粒;2.2 质粒的基本特征;2.2.1质粒的自主复制性; 目前公认的用于阐释质粒DNA复制控制机理的分子模型有两种：其一是自体阻遏蛋白质模型（autorepressor model），其二是抑制蛋白质稀释模型（inhibitor dilution model）。前者的核心内容是，阻遏蛋白质的合成受负反馈（negative feedback）机理调节，而且其浓度是恒定的。后者的关键论点是，阻遏蛋白质是组成型合成，其浓度同质粒的拷贝数成正比。;（1）抑制蛋白质稀释模型 　　它认为质粒DNA的复制，是受一种由质粒DNA编码的抑制蛋白质Cop调控的。细胞中Cop蛋白质的浓度是同质粒分子的拷贝数成正比，它抑制质粒DNA复制活性的作用方式有两种途径：一种是通过同质粒DNA的复制起点（oir）结合，直接地抑制质粒DNA的复制；另一种是通过阻断起始蛋白质Rep的合成，间接地抑制质粒DNA的合成。;（2）自体阻遏蛋白质模型 　　在抑制蛋白质稀释模型提出若干年之后，L.Sompayrac和O.Maaloe也提出了另外一种解释质粒DNA复制机理的自体阻遏蛋白质模型。 　　这个模型对质粒DNA复制控制机理有两种解释： 　　1.质粒DNA的复制是由一种叫做起始蛋白质Rep引发的。Rep蛋白质编码基因rep和自体阻遏蛋白质编码基因atr是属于同一个操纵子，它们共转录成同一个mRNA分子。自体阻遏蛋白质通过同启劝子-操纵基因区（P/O）的结合作用，调节质粒DNA的转录作用，以维持细胞中Arr和Rep蛋白质处于恒定的水平。而后，由Atr蛋白质调节产生的Rep蛋白质，则是通过同复制起点（ori）的结合，来引发质粒DNA的复制[图（a）]。 　　2. Rep蛋白质是一种具有双重功能的蛋白质。它既具有自体阻遏蛋白质的功能，可同P/O区结合而抑制转录作用；同时又具有起始蛋白质的功能，能对复制起点（ori）发生作用，引发质粒DNA进行复制[图（b）];2.2.2 质粒的不相容性;质粒的不相容性：分子机制;2.2.3 质粒的可转移性;;2.2.4 携带特殊的遗传标记;2.3 质粒DNA的分离纯化;氯化铯密度梯度离心法： ;碱溶法： ;碱变性法质粒提取的原理： 根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间，在拓扑学上的差异而???展出来的。 在pH值12.0～12.5范围内时，线性的DNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变性。 通过冷却或恢复中性pH值使之复性，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒DNA。;沸水浴法： ;2.4 质粒的构建;载体改造和构建的原则 ⑴去掉不必要的DNA区段。 ⑵减少限制酶的识别位点，一种酶只保留一个。（单一的限制性酶切位点）。 ⑶加入易于捡出的选择性标记基因。 ⑷对质粒进行安全性改造，要求质粒不能随便转移。 ⑸改造或增加基因表达的调控序列。 ;2.5 质粒的分类;2.6 重要的大肠杆菌质粒载体;重要的大肠杆菌质粒载体;重要的大肠杆菌质粒载体;重要的大肠杆菌质粒载体;穿梭质粒载体：人工构建的具有2种不同复制起点和选择标记，在2种寄主内都能存活和复制，并可携带外源基因往返穿梭的质粒载体;3 噬菌体或病毒DNA;3.1 大肠杆菌的 l 噬菌体;l 噬菌体生物学特性： 生物结构;l 噬菌体生物学特性： 感染周期;;l 噬菌体生物学特性： 溶原状态;3.1.2 l-DNA载体的构建：;l-DNA载体的构建：缩短长度 插入型载体;l-DNA载体的构建：缩短长度 取代型载体;（2） 删除重复的酶切位点;（3） 加装???择标记;加装选择标记 imm434;加装选择标记 lacZ;构建琥珀密码子的突变体 ;3.1.3 l-DNA载体的主要类型：;3.1.4 l-DNA重组分子的体外包装;3.1.5 l-DNA及其重组分子的分离纯化;3.1.6 l-DNA作为载体的优点;3.2 大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA;大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA;大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA;大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA; 与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病毒基因组DNA。;4 考斯质粒与噬菌粒;4.1 考斯质粒（cosmid）;考斯质粒（cosmid）;4.2 噬菌粒（phagemid or phasmid）;噬菌粒（phagemid or phasmid）;噬菌粒（phagemid or phasmid）;5 人造染色体载体;5.1 细菌人造染色体（Bacter