尿微量白蛋白半定量胶体金诊断试剂的研制.docVIP

尿微量白蛋白半定量胶体金诊断试剂的研制 尿微量白蛋白半定量胶体金诊断试剂的研制 摘要：目的制备尿微量白蛋白半定量胶体金快速检测试剂。方法本试剂的硝酸纤维素反应膜上预先喷涂检测线(人白蛋白,HSA)、比色线(羊抗兔IgG多克隆抗体,GAR)和质控线(GAR)三条线，金标反应膜中预先吸附有胶体金标记的鼠抗HAS单克隆抗体和兔IgG，在检测过程中，比色线(R线)色度相当于样本中含有人白蛋白20mg/L时，检测线(T线)的色度，通过比较检测线和比色线颜色的深度，进而半定量的推断样本中人白蛋白的含量。结果通过对本试剂和贝克曼微白蛋白试剂的同步检测141份样本，依次按照小于20mg/L/20-50mg/L和大于50mg/L三个区间进行统计，本试剂的灵敏度、特异性分别为100%、100%，且本试剂与尿液中常见的血红蛋白、人IgG、胆红素以及常见的化学药物，在测试浓度水平，均没有出现交叉反应。结论本试剂可以用于半定量检测人尿液中微量白蛋白的存在，通过肉眼观察作定性验查，具有快速、简便、价廉、不需特殊仪器等优点，很适合于没有特殊仪器的基层医院使用。 关键词：尿微量白蛋白；人血清白蛋白；单克隆抗体；胶体金；硝酸纤维素膜 测定尿微量白蛋白的方法很多，如放射免疫法、免疫浊度法、酶免疫法、免疫荧光 法等。放射免疫法灵敏度高、特异性强，是测定尿微量白蛋白的经典方法，但由于 有放射性污染且试剂保存期短，很难在临床上广泛开展。目前，免疫浊度法是定量测定尿白蛋白的常用方法，但需要昂贵的仪器设备才能进行。因此建立灵敏度好、特异性好、操作简便的尿微量白蛋白胶体金快速检测试剂，满足临床对肾病患者的初筛，同时本试剂可用于高血压和糖尿病患者的疗效监测，及自我检测。 1、材料与方法 1.1、材料 1.1.1、主要生物活性原料 1.1.1.1、鼠抗HSA单克隆抗体 本公司细胞室提供，编号是RH-13HSA，采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化，用于胶体金的标记。 1.1.1.2、兔IgG、羊抗兔IgG多克隆抗体，均由军事医学科学院基础医学研究所提供。 1.1.2、主要试剂 HSA Fraction VHigh Purity：Merck公司产品；Gold Chloride(HAuC14.3H2O)和BSA Fraction V：EMD Chemical Inc产品。 1.1.3、硝酸纤维微孔滤膜(NC膜)：汕头伊能膜业有限公司产品，孔径为8μm。 1.1.4、标准品：人血清白蛋白(HSA Fraction VHigh Purity)：Merck公司产品，准确稀释，标定，-20备用。 1.2、检测试剂 1.2.1、金标结合物反应膜 1.2.1.1、胶体金溶液 在加热煮沸的400ml纯化水中快速加入1%氯金酸溶液8ml，待溶液再次沸腾后，迅速加入2%柠檬酸钠溶液8.8ml，继续煮沸，观察溶液颜色由黄色变灰变黑再变紫，最后变成稳定的酒红色后，计时继续煮沸10min，冷却至室温后，补水至400ml。 1.2.1.2、金标结合物的制备 鼠抗HAS单克隆抗体的标记：取100毫升胶体金，使用0.2M碳酸钾调整至PH8.0，在磁力搅拌下，一次性加入鼠抗HAS单克隆抗体1毫克，搅拌10分钟后静置10分钟；再加入稳定剂(2%BSA+0.1%PEG20000)，搅拌30分钟；采用12000转离心40分钟，小心吸取上清，沉淀为胶体金-鼠抗HAS单克隆抗体结合物，备用。稀释后测定波长521nm处的OD值，将原胶体金标记物使用金标工作液(0.5M硼酸盐(PH9.0)+2%Tween+5%蔗糖+1%BSA+1%水解酪蛋白+0.1%PVA)稀释至30OD。 兔IgG标记：操作步骤同上。取100毫升胶体金，使用0.1M碳酸钾调整至PH7.4，按照每1毫升胶体金对应8μg兔IgG的比例进行标记。经离心后，沉淀为胶体金-兔IgG结合物，稀释至10OD。 分别取上述金标工作液，按照每平方厘米10微升的比例涂布无纺布，室温干燥。 1.2.2、硝酸纤维素反应膜 1.2.2.1、在硝酸纤维素膜上使用BIO-DOT包被机分别喷也制备检测线(T)、比色线(R)和质控线(C)，干燥后以封闭液(0.01M，PH8.0 PBS+2%BSA+2%脱脂奶粉)封闭2小时，在用洗涤液(0.01M,PH8.0,PBS+0.05%Tween20)洗涤3次，干燥。其中检测线(T)使用0.05M，PH9.6CB稀释的HSA(0.5mg/ml),比色线(R)和质控线(C)使用0.02M PB+0.2%BSA进行稀释，浓度分别为0.2mg/ml、1.0mg/ml。 1.2.3、胶体金试剂条 将上述金标反应膜、硝酸纤维素反应膜和其它辅料(吸水纸、玻璃纤维)等依次粘切于白色的塑料基板上，切成3mm试条。 1.3、检测方法 将有箭头标志线一端插入样本收集容器中，确保