新型自身免疫抗体在恶性间皮瘤联合诊断中的分析-analysis of new autoantibodies in combined diagnosis of malignant mesothelioma.docxVIP

摘要摘要背景：恶性间皮瘤是一种罕见的极具入侵性的肿瘤，主要起源于胸膜和腹膜组织间 皮细胞。由于现阶段对此肿瘤的诊断方法大多存在敏感性和特异性不能兼顾等问题，大 部分患者在就诊时已处于晚期。也因缺乏高效准确的早期诊断和治疗方法，患者的平均 生存率仅为 9-12 个月。然而，如果在早期就能对恶性间皮瘤的发生做出诊断，病人的 5 年生存率将预计提高到 40%。因此，开发出一种准确高效的恶性间皮瘤早期诊断方法对 其诊断、治疗和预后都具有重要意义。据 WHO 2011 年的统计结果显示，80%的恶性间 皮瘤的发生与石棉的长期接触有关，并因此导致了长达 30 年或更久的潜伏期。然而， 由于人体免疫系统免疫监视作用的存在，对早期肿瘤的异常变化发生灵敏的反应，产生 自身免疫抗体。因此，为肿瘤的早期诊断提供了依据和可能。本研究致力于应用蛋白芯 片筛选出能够明显区分恶性间皮瘤患者和正常人的新型特异性自身免疫抗体标志物，为 恶性间皮瘤的诊断检测及治疗、预后奠定基础。方法：首先从 5 例恶性间皮瘤患者组织总提取总 RNA，纯化出 mRNA 后，利用 cDNA 合成及克隆系统构建 T7 噬菌体 cDNA 文库。然后，利用病人混合血清和正常人血清对 文库进行淘洗，挑选出的 1000 多个肿瘤特异性噬菌体克隆用于构建蛋白芯片系统。用于训练集的血清样本由 53 份患者血清和 52 份正常人血清构成，这些血清样本与蛋白芯 片反应后，利用 Cy5/Cy3 双荧光检测系统得到原始芯片数据。统计学分析构建出能够明 显区分病人和正常人的检测分类器后，再利用验证集血清样本（50 份患者血清和 50 份 正常人血清）对此分类器进行双盲验证分析。最后，利用 PCR 电泳纯化后，对此分类 器中的 cDNA 克隆进行测序，BLASTN 比对分析。结果：构建的恶性间皮瘤 T7 噬菌体 cDNA 文库，经测定，原库滴度为 5.6×106 pfu/mL。PCR 鉴定从原始文库中随机挑取的 100 个噬菌斑，重组率为 95%，重组体中插 入片段长度为 100-500 bp。生物淘洗后，文库滴度为 1.3×103 pfu/mL，挑取其中的 1008 个肿瘤特异性噬菌体克隆构建蛋白芯片，经双荧光蛋白检测系统对训练集进行检测及统 计学分析后，得到一个由 9 个肿瘤特异性自身免疫抗体标志物组成的诊断分类器。经逻 辑回归等方法分析后，发现此分类器的诊断敏感性为 94.3%，特异性为 90.4%，ROC 曲I摘要线下面积即 AUC 为 0.89。验证实验中，此分类器的诊断敏感性和特异性有所降低，分别为 86.0%和 86.0%，ROC 曲线下面积为 0.82. 测序和 BLASTN 比对结果显示，此分类 器 中 的 5 个 候 选 标 志 物 的 相 关 文 献 显 示 其 与 癌 症 相 关 (PDIA6, MEG3, SDCCAG3,IGHG3, IGHG1)。结论：通过本研究得到了由 9 个自身免疫抗体候选标志物所组成的联合诊断分类器。 与同期的其他标志物或诊断方法相比，此分类器在恶性间皮瘤诊断中具有较高的诊断敏 感性和特异性。此诊断分类器的成功构建将丰富恶性胸膜间皮瘤的标志物资源库，为此 癌症的早期诊断、治疗及预后夯实基础。关键词自身免疫抗体胸膜恶性间皮瘤噬菌体展示cDNA 文库蛋白芯片IIAbstractAbstractBackgroundMalignant mesothelioma (MM) is a rare but extremely aggressive cancer that originates from mesothelial cells of the pleural membranes and peritoneal tissues. Since symptoms are vague, and diagnostic tools are not sensitive and specific enough to detect, the disease is delayed until it reaches advanced stages. The survival rate has been hampered by the lack of efficient and accurate early detection methods with only 9-12 months survival time. However, the 5 year survival rate can be increased to 40% when it can be diagnosed in early stage. According to the survey by WHO, 80%