高糖诱发氧化应激反应激活tnfr受体促内皮祖细胞凋亡的实验研究-外科学专业论文.docx

目录l高糖诱发氧化应激反应激活TNFRl受体促内皮祖细胞凋亡的实验研究11．1中文摘要11．2英文摘要41．4材料与方法000000B OO000111．5结果211．6讨论···371．7结论············451．8参考文献000000461．9英汉缩略词对照表522致谢·········533活性氧簇对创口愈合过程中血管新生的影响(综述)。。。‘‘。‘‘。。‘‘。。‘。‘‘‘‘‘。‘‘‘’。。。‘。。。。‘‘‘。。‘·。·································55万方数据四川医科大学硕士学位论文高糖诱发氧化应激反应激活TNFRl受体促内皮祖细胞凋亡的实验研究摘要目的：糖尿病(Diabetesmellitus，DM)是因遗传和坏境因素共同作用而引起的高血糖以及碳水化合物、脂肪和蛋白质等代谢失衡的慢性疾病。它不仅引起糖代谢紊乱，而且引起血管病变。内皮祖细胞(Endothelialprogenitor cells，EPCs)在维持血管健康和促进受损血管的重建过程中起着重要作用。当前，在糖尿病血管新生受损的机制研究中，EPCs功能失调相关因素已经受到广泛重视，其中，氧化应激与EPCs功能失调关系密切。已有研究表明：糖尿病患者的高血糖环境可以使EPCs凋亡增多，数量减少，而且凋亡增加可能是糖尿病血管病变中EPCs减少的主要机制。细胞凋亡是由基因控制的一种自主性、程序性的死亡过程，它可以由多种刺激因素引起并且主要通过死亡受体介导的途径介导凋亡，在死亡受体介导的凋亡途径中，肿瘤坏死因子受体(Tumornecrosisfactorreceptor，n师R)是当前研究发现的最大的死亡受体家族，其凋亡信号传递过程中，主要是由TNFRl介导的。有研究报道高糖能诱导EPCs中TNFRl表达，这种效应能被抗氧化剂抑制。因此，本实验主要通过观察体外高糖是否通过氧化应激反应激活TNFRl及其下游的凋亡信号通路，进而对大鼠骨髓源性EPCs凋亡产生影响，来探讨高糖对EPCs的作用和影响。方法：用颈部脱臼法处死SD大鼠，将其置于75％酒精中，浸泡并消毒15min。然后将消毒后的大鼠放置于超净工作台上，用动物解剖器械分离大鼠的股骨和胫骨，分离完成后，用含1％肝素的无菌PBS液冲洗骨髓腔，直到冲洗液变无色透明为止，收集好冲洗液，并用离心机进行高速离心，离心后收集试管底部的细胞，选择使用Ficoll密度梯度离心法进行大鼠骨髓源性单核细胞的分离；万方数据四川医科大学硕士学位论文分离后，将其接种于6孔板中，3天后进行首次换液，以后每隔3—4天换液，连续使用倒置显微镜观察细胞的形态变化并且使用激光共聚焦显微镜观察鉴定经DiI．acLDL和FITC．UEA．1双荧光染色的EPCs；用流式细胞仪检测经过不同含糖浓度(5．5、15、30、60mmol／L)处理后的EPCs凋亡率，挑出最佳浓度；使用高糖(30mmol／L)和氧化应激拮抗剂Tempol、TNFRl受体拮抗MAB430共同作用，流式细胞仪检测细胞凋亡率；使用分子探针(DCFH．DA)检测不同糖浓度处理后EPCs的活性氧(Reactiveoxygen species，ROS)含量变化；使用Westernblotting检测不同糖浓度和TNFRl受体拮抗MAB430处理EPCs后，其细胞表面TNFRl受体以及由其介导的细胞内信号通路相关蛋白(TRADD、TRAF2、RIP、NF．kBp65、Caspase3)表达的情况。结果：在使用M199培养基培养3天后，EPCs大部分贴壁，呈圆形，逐渐增大伸展，培养至7天后，细胞生长迅速，镜下可见其呈集落样生长，培养至14天后，观察可发现细胞出现“鹅卵石”样形态分布。通过激光共聚焦显微镜观察细胞可见经过DiI．ac．LDL处理后阳性的EPCs为红色荧光，结合了FITC．UEA．1后的EPCs为绿色荧光，双染法阳性的细胞为正在分化的EPCs，表明所培养的细胞为EPCs。在高糖刺激EPCs的早期(24-48h)，高糖组与对照组之间比较，没有明显的凋亡增加，而随着高糖刺激时间的延长，即高糖刺激的晚期(72—96h)，可以发现高糖刺激组与正常对照组比较，凋亡细胞数目增加，高糖组(15mmol／L，30mmol／L，60mmol／L)与对照组进行组内比较，具有统计学意义(PO．01)；在同一时间点，将30mmol／L，60mmol／L的高糖组分别与15mmol／L高糖组相比，早期没有发现明显凋亡，而在刺激的晚期，仅发现60mmol／L的高糖组与15mmol／L的高糖组比较，细胞凋亡增加，具有统计学意义(P0．01)，在分别使用抗氧化剂Tempol、TNFRl受体拮抗剂MAB430处理EPCs24h、72h后，在与高糖组(30retool／L)分别在24h