禽流感病毒H5N1病毒颗粒中鸡胚宿主蛋白质谱分析.docVIP

禽流感病毒H5N1病毒颗粒中鸡胚宿主蛋白质谱分析 　　摘 要 在A型流感病毒等许多包膜病毒的病毒颗粒中，除包含病毒基因组编码的结构蛋白外，还包含来源于宿主细胞的多种蛋白。然而，在鸡胚内增殖的病毒颗粒所包含的宿主蛋白的种类尚不清楚。本研究采用20%～60%（w/w）蔗糖密度梯度离心法分离纯化了繁殖于鸡胚的流感病毒，并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS）结合质谱法对纯化的流感病毒颗粒进行了全面的蛋白质组学分析。结果表明，在病毒颗粒中，除包含9种病毒编码蛋白外，还发现了?12种来源于鸡胚的蛋白，如膜联蛋白A2、肽酰脯氨酰顺反异构酶B、过氧化物酶1、磷酸甘油酸激酶、丙酮酸激酶肌组织异构酶等，以及2种细胞骨架蛋白（微管蛋白b-3和肌动蛋白）。 　　关键词 鸡胚； 流感病毒； 凝胶电泳； 质谱分析 　　 2011-06-08收稿；2011-10-25接受 　　本文系国家自然科学基金（No、吉林省科技厅（Nos20110739 和吉林大学基本科研业务费（Nos. 450060445316，450060326056）资助。 　　* E-mail: zhouqw@jlu.省略， liu_ning@jlu.省略 　　1 引 言： 　　包膜病毒是一类在核衣壳外包有脂质双层膜的病毒，包膜来自受感染宿主细胞的细胞膜或核膜。目前认为，成熟的包膜病毒颗粒中除包含其基因组编码的结构蛋白外，还包含多种宿主蛋白[1]。在病毒颗粒中已发现了系列宿主蛋白[2～5]，其中一些蛋白对病毒的复制和包装有重要作用[6～8]。流感病毒是一种包膜病毒，其成熟病毒颗粒含有9种病毒基因组编码的结构蛋白。通过蛋白质组学方法可对在Vero细胞中增殖的流感病毒进行分析，发现成熟的病毒颗粒结合有36种宿主蛋白[9]。目前，此类研究均选择来源于哺乳动物的细胞株作为流感病毒增殖的宿主。 　　在细胞培养技术发展起来之前，研究者多采用鸡胚作为流感病毒增殖宿主。由于成本低、产量高，鸡胚已成为生产流感病毒疫苗的主要宿主。但是，鸡胚与细胞株在很多方面存在差异。在鸡胚内增殖的流感病毒颗粒结合宿主蛋白的情况尚不清楚，因此有必要对在鸡胚内增殖的流感病毒颗粒所包裹的来源于宿主鸡胚的蛋白进行全??的分析。据此，本研究采用SDS与质谱分析结合的方法，分析了纯化的在鸡胚内增殖的流感病毒颗粒的蛋白组成谱，发现除了9种病毒编码蛋白外，还有12种鸡胚宿主编码的蛋白结合于病毒颗粒内。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　Optima L-100K超速离心机（美国Beckman Coulter公司）；ZipTip C??18 Pipette Tips微量层析柱（美国Millipore公司）；PicoTip电喷雾针（美国New Objective公司）；纳升电喷雾源（丹麦Protana公司）；QSTAR四极杆飞行时间串联质谱仪（美国Applied Biosystems公司）；Mini-Cell垂直电泳仪（美国Bio-Rad公司）；GS800扫描仪（美国Bio-Rad公司）。 　　乙腈和甲醇（HPLC级，Fisher公司）；测序级胰蛋白酶（Promega公司）；抗烯醇化酶1和抗溶菌酶C的单克隆抗体（Santa Cruz公司）；BCA蛋白检测试剂盒（Pierce Chemicals公司）；A型禽流感病毒H5N1（Avian influenza virus A/Chicken/Hong Kong/YU22/2002），在III级生物安全实验室（BL-3）中进行培养。 　　2.2 病毒培养和离心纯化 　　将A型禽流感病毒H5N1接种于鸡胚中，在35 ℃条件下孵育72 h，收集尿囊液；用0.03%福尔马林在4 ℃灭活72 h；将含有病毒的尿囊液以5000 r/min离心15 min，收集上清液。所有对活病毒进行的实验操作均在三级生物安全实验室完成。 　　将上述含有灭活病毒的上清液在4 ℃以40000 r/min离心1 h，弃去上清液，沉淀悬浮于含有?10 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0）、150 mmol/L NaCl和25 mmol/L β-巯基乙醇的缓冲液中。取适量病毒悬液，加入到20%～60% （w/w）蔗糖梯度溶液液面上，于4 ℃以23000 r/min离心16 h，收集含有病毒的区带，再以40000 r/min离心沉淀病毒颗粒1 h，用上述缓冲液重悬沉淀。以上操作至少重复3次，以保证病毒颗粒的纯度。收集含有病毒的区带，混悬于上述缓冲液中，冻存于 　　?Symbolm@@ 80 ℃待用。