扬州大学 《动物细胞工程》课件 胚胎干细胞教学教材.pptVIP

1.造血细胞 造血细胞是报道最多的一种分化细胞类型。 小鼠ES细胞拟胚体在体外可分化为类似于早期胚胎卵黄囊血岛样的结构，分化产生红细胞、髓细胞和淋巴细胞等各种造血系统的细胞。 常采用分阶段诱导小鼠ES细胞分化为造血细胞和B淋巴细胞。 用巯基乙醇等药物或细胞基质处理，发育成拟胚体 用胰蛋白酶消化成单一细胞 干细胞因子（SCF）、血小板生成素（TPO）和胚胎细胞的条件培养液处理，定向分化为造血干细胞 原代骨髓细胞作饲养层和SCF及IL－6细胞因子处理 可进一步分化为B淋巴细胞系 将胚泡接种于预先铺有作为滋养层而无有丝分裂活性的单层MEF细胞的培养皿中 用免疫手术法分离胚泡的ICM细胞，或用常规培养法分离出ICM细胞进一步培养。 培养2－3天 免疫手术法 4－4.5dpc的小鼠胚泡主要由已分化的滋养外层胚层和未分化的ICM细胞组成，前者细胞表面一般已表达主要组织相容性复合体（MHC），能识别其相应抗体和形成免疫复合物，在补体存在时可导致细胞发生免疫溶解。 具体操作如下： 体外培养的胚泡，用酸性Tyrode`s液（pH2.5）处理，去除透明带； Hank`s洗涤，加入兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清（抗H－2b）； 移至含新鲜豚鼠血清的培养液， Hank`s液洗涤后，移至96孔铺有MEF或STO饲养层细胞和DMEM基本培养液的板内进一步培养。 30min 胚泡的滋养外胚层细胞呈泡状，发生免疫溶解；而ICM细胞不具H－2b抗原，细胞完整； 30min 常规培养法 未去透明带的胚泡培养3－4天，ICM细胞团从贴壁胚泡内长出来； 胰蛋白酶和EDTA混合消化液在37℃消化5min； 解离的细胞团移至滋养层的24孔培养板，继续培养4天，可在一些孔内见到巢状胚胎干细胞团； 胰蛋白酶消化巢状胚胎干细胞团并继续培养，克隆和纯化ES细胞。 视ES细胞巢密度转移到较大容积的培养皿或培养瓶。 EG细胞的培养过程 哺乳动物原始生殖细胞（PGC）最早发生于近尿囊基部的卵黄内胚层内，随着胚胎发育和纵向转折，卵黄囊的一部分成为胚胎的后肠，PGC取材主要根据其在不同物种的早期胚胎中所处迁移位置而定。 1、原始生殖细胞的分离和原代培养 收集8.5－10.5dpc小鼠胚胎，用D－Hank`s液轻洗后，在解剖镜下用镊子剖取包含原始生殖细胞（PGC）的生殖嵴组织； 以0.02%EDTA液孵育含PGC细胞的生殖嵴组织，37℃,15min； 吸管轻吹打散，接种于铺有滋养层的4孔培养板内。 基本培养液 DMEM液 15%－20% FCS 0.1mmol/L　β－巯基乙醇 50U/ml青霉素、50ug/ml链霉素 2mmol/L谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠 2、滋养层细胞 宜用8代以内的小鼠MEF细胞或STO细胞系。 用前经10ug/ml丝裂霉素C在37℃处理2－3h； 接种于包被0.1%明胶的培养板或细胞瓶内，培养液为含10%小牛血清的DMEM。 3、EG细胞纯化和建系 培养物在滋养层细胞上分裂增殖，4－6天后在显微镜下将包含原始生殖细胞的细胞团用胰蛋白酶消化并转移至新滋养层细胞上增殖； 重复用胰蛋白酶消化并转移至新的滋养层细胞，经过2－3次过程，一般可产生巢状（nests）生长的干细胞集落； 最后将它转移到铺有滋养层细胞的培养瓶内进一步扩增，此时培养液中可减少或省略LIF、SCF和bFGF等生长因子。 五、ES细胞和EG细胞系的特性和鉴定 1 形 态 学 特 征 将克隆挑出，用胰蛋白酶消化并接种于新的滋养层或特定的条件培养液中，培养3－4天后，分散的细胞又重新呈岛状或巢状的细胞克隆。 圆形或卵圆形，彼此均呈单层或多层紧密堆积而形成岛状或巢状群体生长形态； 呈现一个或几个核仁、核质比例高； 不同种的ES细胞形态学特征有所不同。 人体ES细胞呈扁平状群落，而且细胞界限清楚； 小鼠ES细胞或EG细胞虽然聚集成团，但呈悬浮状态，细胞界限也较清楚； 猪ES细胞具有特征性细胞骨架蛋白表达的上皮细胞表型。 2、发育全能性和分化潜能鉴定 免疫组织化学 ①时期专一性胚胎抗原（SSEA） ②碱性磷酸酶（AKP） ③Oct－4基因表达 ④端粒酶（telomerase） ⑤体外分化潜能 ⑥体内分化 ①时期专一性胚胎抗原 （stage-specific embryonic antigen, SSEA） 间接免疫荧光法检测ES和EG细胞表面抗原。 不同种属具有亚型，小鼠SSEA－1型，人SSEA－3或SSEA－4亚型。 ②碱性磷酸酶（AKP） 小鼠胚胎干细胞中活性较高，已分化细胞中活性明显降低。 细胞经1%多聚甲醛固定，直接用AKP底物NBT液染色，未分化细胞具有较高的AKP酶活性，显示深蓝紫色