山东大学研究生国家精品课程基因工程学原理工具酶.pptVIP

第二部分 基因工程工具酶及其应用 限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。 一、核酸内切酶restriction endonuclease, RE 是一类能从DNA分子中间水解磷酸二酯键,从而切断双链DNA的核酸水解酶。 存在于原核及真核细胞中，但在原核细胞中表达丰富，可以限制外来DNA的侵入并使之失去活性，但不影响自身DNA 是原核生物限制-修饰（R-S)系统的重要组成： R-S系统： 限制性内切酶常常伴随一到两种修饰酶(甲基化酶)出现。修饰酶识别的位点与相应的限制性内切酶相同,但只甲基化每条链中的一个碱基,而不是切开DNA链，使得DNA不被切割，因而其作用是保护细胞自身的DNA不被限制性内切酶破坏。 限制性内切酶的生产 分离纯化----克隆表达 （NEB） 到 2005 年 1 月，共发现 3681 种限制酶，其中Ⅰ 型、 Ⅱ 型、 Ⅲ 型限制酶各有 59 、3612 、10 种；商业化的限制酶有 588 种，其中 Ⅱ 型限制酶中共有 221 种特异性。 （二）限制性内切酶的命名 I 型限制性核酸内切酶 II 型限制性核酸内切酶 III 型限制性核酸内切酶 复合功能酶，具有多种功能： R 亚基： hsdR基因编码 ——酶切 M 亚基： hsdM 基因编码 ——修饰作用 S亚基： hsdS 基因编码 ——识别DNA序列 在DNA链上的识别和切割位点不一致 没有固定的切割位点，在距识别位点1至几个kb处随机切割，不产生特异末端。 III 型限制性酶 属于复合功能酶 R 亚基： hsdR基因编码 ——酶切 M S亚基： hsdM 、hsdS基因编码 ——识别DNA序列、修饰作用 特点：在距识别位点约25bp处切割DNA，切割位点难以预测。 II 型限制性酶 Ⅱ 型限制酶一般是同源二聚体（homodimer），由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成，每个亚单位作用在 DNA 链的两个互补位点上 特点：在识别位点中或靠近识别位点切割。 各类RE的比较 （四） II 型限制性酶(p45) 1、功能特点：识别和切割双链DNA的特定序列，产生特定的DNA末端。 2、II型酶识别序列特点：识别序列一般在4～6个碱基对，通常为反向互补序列，即具180°旋转对称性，又称回文结构 （ Inverted Palindrome） 3、 酶切末端类型 1)平齐末端（blunt or flush end）: 在识别序列的对称轴上切割双链DNA ,形成平齐末端。 2)粘末端（cohesive end or sticky end ) 在识别序列对称轴的相应位点切割靶基因，产生一条p5’ 单链延伸的粘性末端。 5’ 粘性末端 3’ 粘性末端 在识别序列对称轴的3’ 末端切割，产生3’- OH单链延伸的粘性末端。 4、几类特殊的II 型限制性酶（p47） 异源同工酶（isoschizomers）（p47） 同尾酶（isocaudarner enzyme）（47） 识别与切割顺序相互有关的酶。来源各异，识别序列也各不相同，但作用后产生相同的粘性末端。 远距离裂解酶（distant cleavage enzyme ) (47） 这类酶的识别与切割位点不一致，但其切割位点和识别位点的距离是一定的，一般为10个碱基左右。 MboII GAAGANNNNNNNN Hga I GACGCNNNNN 可变酶( variable enzyme)p48 II型酶中一个特例，他的识别序列中有一个或几个核苷酸是可变的，且识别序列一般大于6个碱基对。 BstpI GGTNACC （其中1个碱基可变） Bgl I GCC（N）4 N GGC (识别序列中有5 个碱基可变） 5、影响II型限制性酶作用的因素(p48) 离子强度、pH的影响 如 MgCl2由5mM 2mM (pH8.5)使酶对底物识别专一性降低 EcoRI GAATTC EcoRI* NAATTN 酶量的影响 ：过量会影响酶的识别顺序 一般应参考酶切单位. 其他影响因素： 酶切反应温度、酶解时间、某些试剂等 均可改变酶的专一性 如 疏水试剂甘油，二甲基亚砜存在时，会使BamH I 的识别和切割特异性发生改变