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利用PCR反应进行人类性别鉴定教程教案.ppt
实验八 PCR反应鉴定人类性别;二、PCR反应的原理; PCR主要由反复循环的变性、退火和延伸三个步骤构成：即在高温（95℃）下，使靶DNA双链受热变性成为两条单链；而后在低温（37～55℃）下，两条寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，经过一次循环目的DNA产物增加1倍。如此反复进行，PCR产物得以2n的指数形式迅速扩增。 ; ;PCR反应体系的组成;脱氧核苷三磷酸（dNTP） 作为DNA合成的基本原料。dNTP含量太低，PCR扩增产量太少、易出现假阴性。过高的dNTP浓度会导致聚合时的错误掺入，因此应当避免。一般在200μmol/L浓度下使用。;耐热DNA聚合酶 目前有两种Taq DNA聚合酶供应：从噬热水生菌Thermus Aquaticus（Taq）中分离提纯的天然酶和大肠杆菌合成的基因工程酶。在PCR反应中，每100μl反应液中含1-2.5U Taq DNA聚合酶为佳，酶的浓度太低会使扩增产物产量降低，如果酶的浓度太高则会出现非特异性扩增。;温度循环参数 变性温度与时间 通常选用95℃ 30s。 复性温度与时间 复性温度决定着PCR的特异性。温度越低复性越好，但是容易出现错配，温度太高不利于复性，通常为55℃左右。 延伸温度与时间 一般为72℃。这个温度即考虑了Taq DNA聚合酶的活性，又考虑到引物和靶基因的结合。 循环数 循环数决定着扩增的产量。在其它参数都已优化条件下，最适循环数取决于靶序列初始浓度。 ;三、利用PCR反应进行性别鉴定;四、实验材料;五、实验步骤;（二）、加样及PCR扩增;2.设置对照： 空白对照 阴性对照 阳性对照;（三）、扩增参数;（四）、电泳与结果判断
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