【医学超级全核医学】第六篇 章 .pptVIP

标记抗原的要求 1、质同，即标记抗原与标准抗原、待测抗原的化学性质和免疫活性要相同。 2、标记抗原要有适当高的放射性比活度。 比活度高则在允许的相同的测量统计误差的前提下，所使用的标记抗原的量必然减少，那么在反应中与之竞争的待测抗原的量也相应减少，方法的灵敏度就提高了。 但过高的比活度，也会引起诸如辐射自分解和免疫活性受损的问题。 3、标记抗原要有足够高的放射化学纯度，一般要大于95%。 放射化学纯度不高，可能使一些放射性的杂质对RIA的免疫反应和动力学参数产生影响。 由于存在放射性核素的衰变，因此在长期储存后的标记抗原一般要经过重新提纯后才能再次使用。 4、标记抗原的稳定性要好： 和标准抗原相比，标记抗原由于有了放射性核素射线的影响，更容易发生分解。 在标记抗原的储存上，应遵循标记化合物的保存原则即低温、降低比放射性、清除自由基等。 （三）特异性抗体 包括多克隆抗体和单克隆抗体。 抗体的质量之间关系到RIA分析方法的灵敏度和特异性。 抗体的要求（三高） 高亲和力 高特异性 高滴度 抗体的检测指标 1、亲和常数K（affinity constant）： 亲和常数反应了抗体与抗原的亲和力。 K值越大，形成抗体抗原复合物速度快，解离少，灵敏度高，准确度和精确度都好。 K=结合常数k1 / 解离常数k2 。 2、交叉反应率： 指抗体识别相应抗原类似物的能力，反应了抗体的特异性。 在生物体内的复杂环境中，许多生物活性物质都有很多相似的类似物，例如甲状腺素中就有T3、T4、rT3等，雌激素里又有雌二醇、雌三醇等。 交叉反应率越低，则说明抗体与抗原类似物的交叉反应就越小，其识别抗原类似物的能力就越强，特异性就越强。 常用50%置换法来测定交叉反应的百分率。 即将被测物质和其类似物，分别作竞争抑制曲线，比较两者在其结合率为零管（B/B0）的50%时的剂量响应浓度，其比值即为交叉反应百分率，也就是该抗体对被测物某种类似物的相应活力。 3、滴度： 又称稀释度，反映了抗血清中有效抗体的浓度。 指在没有标准抗原存在的时候，结合50%的标记抗原时抗血清的稀释度。 其方法就是用缓冲液将抗血清稀释为不同的浓度，各置于试管中，然后各加一定量的标记抗原进行反应，等到反应平衡后分离B和F，测出B的放射性，算出B%，以B%为纵坐标以抗血清的稀释度为横坐标作出抗血清稀释曲线，B%为50% 所对应的抗血清滴度为工作滴度。 三、RIA的分离方法 指分离标记抗原抗体复合物（B）和游离标记抗原（F）的方法。 根据使用的分离剂不同可以分为： 非特异性分离方法：利用物理、化学或生物化学的方法如吸附、过滤、沉淀等。 特异性分离方法：利用免疫反应的特异性来进行分离的方法如双抗体法等。 （一）分离方法的要求 分离完全、快速。 不影响免疫反应的平衡，即是要求在分离过程中不使抗原-抗体复合物解离或形成新的复合物。 受环境因素（温度、PH值等）的影响小。 操作简便，分离剂来源丰富、价廉。 （二）非特异性分离方法 1、吸附法： 利用表面活性物质将反应液中的中小分子，即游离部分F吸附，离心后将大分子B留在上清夜中达到分离的目的。 常用的表面活性物质是葡聚糖凝胶和活性碳颗粒。 2、过滤法： 用一定规格孔径的滤膜过滤，大分子不能通过而留在滤膜上，达到分离的目的。 常用0.22μm的醋酸纤维薄膜。 3、沉淀法： 在溶液中，大分子的标记抗原抗体复合物由一层水分子膜所包被，使其能够溶解在溶液里。 在溶液中加入一定量的沉淀剂如聚乙二醇，乙醇等可以破坏大分子的水包膜，使大分子互相靠拢，形成更大的分子而沉淀下来。 （三）特异性分离方法 1、双抗体法： 用待测抗原的抗体（第一抗体，Ab1）作为抗原去免疫另一种属的动物而产生新的抗体（第二抗体，Ab2），Ab2 可以和Ab1特异性结合而形成更大的Ag-Ab1-Ab2三联复合物而沉淀。 此法特异、高效、非特异结合低、重复性好。 2、固相法： 将第二抗体用一定的方法涂在试管等容器的内壁上，然后直接在试管内进行反应，平衡后抗原抗体复合物连接在试管壁上，直接将上清液倒掉后就可以测定试管的放射性，十分方便。 3、磁性微粒分离技术 是一种新兴的分离技术。 磁性微粒是用高分子材料和金属离子如Fe3O4为原料，聚合而成的一种以金属离子为核心，外层则均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒。 使用时磁性微粒经过特异性抗体包被制成的免疫磁性微粒以悬浮液状态存在于反应溶液中，在反应中与抗原结合形成复合体后，当受外加磁场吸引的作用磁性微粒可快速沉降而自行分离，无需离心沉淀，因而使操作过程大为简化。 磁化分离技术的突出优点是： （1）非特异结合率低； （2）磁化固相颗粒在反应系统呈悬浮