谷氨酸依赖型氨转移酶量筛选法及其应＊.pdfVIP

中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology 谷氨酸依赖型氨基转移酶的高通量筛选方 法及其应用＊ ＊＊ ＊＊ 贺霖伟 刘璋敏 冯雁 崔莉 （上海交通大学生命科学技术学院 微生物代谢国家重点实验室 上海 200240） 摘要 目的：建立谷氨酸依赖型氨基转移酶-谷氨酸脱氢酶偶联反应的96 孔板高通量筛选方 法，并用于大肠杆菌氨基转移酶WecE 突变库的筛选。方法：通过优化偶联指示酶-谷氨酸 脱氢酶、信号分子NADH 浓度及双酶偶联反应时间，建立了光学法测定氨基转移酶活性的 氨基转移酶-谷氨酸脱氢酶偶联反应方法；通过定点饱和突变技术构建了大肠杆菌氨基转移 1 酶WecE 的突变库；采用96 孔板高通量初筛、摇瓶复筛获得了高活性的转氨酶突变体，并 v 3 对纯化的突变体进行催化活力分析。结果：建立了谷氨酸依赖型氨基转移酶目标反应与0.5 6 6 U/mLL-谷氨酸脱氢酶和0.4mmol/LNADH 信号指示反应相偶联的筛选方法；构建了氨基转 0 0 移酶WecETyr 321饱和突变库，通过96孔板高通量筛选，获得了催化活性比野生型提高3.4 . 7 倍的突变体Y321F。结论：本研究建立了高通量筛选方法，背景干扰小，准确性高，为谷氨 0 7 1 酸依赖型氨基转移酶分子进化提供了可行性方案。 0 2 关键词 谷氨酸依赖型氨基转移酶 L-谷氨酸脱氢酶 高通量筛选 分子改造 : v 中图分类号 Q81 i X a 氨基转移酶（Aminotransferase,EC2.6.1.X）作为生物催化剂有高立体选择性、 n i [1] h 高区域选择性和高底物特异性等诸多优势 ，尤其是以谷氨酸依赖型氨基转移酶， c [2] 在工业上常用于催化合成重要的药物中间体。Yoshikane 等 以谷氨酸依赖型氨 基转移酶PPAT生产预防和治疗糖尿病的药物吡哆胺，提高了生产效率；Cho 等 [3]利用嗜热L-氨基酸氨基转移酶，以L-谷氨酸为氨基供体合成抗高血压药物高 苯丙氨酸，降低了生产成本。然而，天然酶在催化活性及底物选择性等方面还不 [4] 尽理想 ，应用蛋白质工程技术提升对非天然底物的催化能力，将扩展其在工业 生产中的应用范围。 利用定向进化或半理性分子设计所建立的大容量突变库，为获得催化性能提 [5] 升的突变体奠定了基础 。然而常规针对氨基转移酶产物的HPLC 等检测手段通 ＊ 国家“973”计划资助项目 （2012CB721000） ＊＊ 通讯作者，电子邮箱：yfeng2009@sjtu.edu.cn ＊＊ 通讯作者，电子邮箱：cuili@sjtu.edu.cn 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology 量有限，极大的限制了获得突变体的效率。基于紫外/荧光等光学检测方法具有 [6] 操作简便、筛选通量高等优势，得到了研究者的关注 。根据转氨反应中氨基供