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采用同源重组技术改良枯草芽孢杆菌安全基因组 　　枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是革兰氏阳性细菌，是一种重要工业酶制剂的生产菌，中国农业部批准使用的安全菌株，现已广泛应用于食品发酵行业. 　　在基因工程操作中，因为高拷贝外源质粒在B. subtilis中的稳定性较差，造成复制过程中大量单链脱氧核糖核酸（deoxyribose nucleic acid,DNA）的产生。单链DNA的积累，最终导致质粒的不稳定,质粒的不稳定性成为基因工程操作的最大障碍.因此，对于B. subtilis的基因改造主要是针对染色体基因组的改造，将外源基因整合到B. subtilis菌株染色体上. 　　在前期的研究中，实验室已从贵州地区豆豉样品中分离获得可作为工业生产应用的菌株BJ3-2,但其谷氨酰胺酶活性较低。这就需要运用基因工程的方法对BJ3-2进行基因组改造，将高活性的glsA基因整合到BJ3-2中，形成新的工程菌株.考虑到BJ3-2应用于食品中的安全性问题，选择可通过升温消除的温敏型质粒载体pKSV7.研究采用同源重组技术有效改良食品级安全基因组,为下一步将高活性谷氨酰胺酶基因定点整合入BJ3-2菌株获得重组菌株提供了依据和理论基础。 　　1 材料与方法 　　 　　1.1 材料与试剂 　　菌株：Escherichia coli DH5α、B. subtilis BJ3-2为本实验室保藏菌株。 　　质粒：pET28b为本实验室保存；pKSV7为军事医学科学院馈赠。 　　Taq聚合酶、限制性内切酶、DNA Marker:日本TaKaRa公司；基因组提取试剂盒：北京Promega生物技术有限公司；质粒提取试剂盒：美国OMEGA生物技术公司；氯霉素：北京SOLARBIO科技有限公司；细菌谷氨酰胺酶检测试剂盒：上海GENMED医药科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。 　　1.2 仪器与设备 　　MyCycler型PCR仪、Gel Doc XR型Universal Hood凝胶成像分析仪、165-2660型电穿孔系统（GenePulserXcell）： 　　美国Bio-Rad公司；Sonifier 450D型超声破碎仪：美国BRANSON公司；SHZ-82型恒温水浴锅：江苏金坛市医疗仪器厂；DHP-9162型电热恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；SKY-2102C型恒温摇床：上海苏坤实业有限公司；SW-CJ-IFD型标准型净化工作台：上海锦星科学仪器有限公司。 　　1.3 方法 　　1.3.1 目的基因组文库构建B. subtilis基因组DNA提取、质粒提取依照试剂盒说明书进行；DNA酶切、片段回收、连接采用常规方法。 　　1.3.2 引物设计根据美国国家生物技术信息中心（national center ofbiotechnology information,NCBI）上查询得到的B. subtilis168菌株的基因组序列，定位glsA基因位置。截取glsA基因上游825bp片段作为上游同源臂Uarm;截取glsA基因下游902bp片段作为下游同源臂Darm;按pET28b载体上Kan基因序列设计引物；检测引物（detection primer,DP）为同源臂的上下游204bp和137bp位置处。基因构建的结构见图1,扩增基因名称和引物序列见表1.【图1.表1】 　　 　　1.3.3 含Kan双交换整合载体（pKUKD）的构建以pKSV7质粒为骨架，分别克隆入Uarm、Darm片段和Kan基因3个基因片段。Kan为重组菌株BJ-Kan抗性筛选标记，构建过程见图2.【图2】 　　 　　由图2可知，以B. subtilis BJ3-2基因组为模板，引物PUarmF/PUarmR和PDarmF/PDarmR扩增得到Uarm和Darm片段；以pET28b为模板，引物PkanF/PkanR扩增得到Kan基因.Hind III和Pst I对Uarm片段及pKSV7质粒进行双酶切、连接，并转化E. coli DH5α,获得pKSV7-Uarm重组质粒.Pst I和BamH I对Kan基因及pKSV7-Uarm质粒进行双酶切、连接，并转化E. coli DH5α。获得pKSV7-Uarm-Kan重组质粒.BamH I和Kpn I对Darm片段及pKSV7-Uarm-Kan质粒进行双酶切、连接，并转化E.coli DH5α。获得pKSV7-Uarm-Kan-Darm即pKUKD重组质粒。 　　 　　1.3.4 测序及比对pKUKD质粒构建完成后，送至英潍捷基公司测序。测序结果通过BLAST程序与B. subtilis 168菌株进行同源性比对，验证构建序列是否正确. 　　1.3.5 同源重组介导glsA基因的敲除将pKUKD载体电转化到BJ3-2菌株感